分子生物学辅导笔记(共24页)

1、（前4章注意概念(ginin)就行了，重点是转座子，RNA编辑）Chapter1真核生物基因组结构(jigu)与功能的特点本章(bn zhn)应掌握的基本概念细胞核基因组的大小；C值矛盾；重复序列；基因家族；真核基因的断裂结构 基因家族（gene family) 指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。假基因（pseudogene) 在多基因家族中有的成员并不能表达出有功能的产物。1、核酸序列相同：即为多拷贝基因如rRNA基因家族，tRNA基因家族，组蛋白基因家族。2、核酸序列高度同源：如人类生长激素基因家族包括三种激素的基因，人生长激素、人胎盘促乳素和催乳素，它们之间高度同

2、源。3、编码产物有同源功能：基因序列的相似性可能较低，但基因编码的产物具有高度保守的功能区。如src癌基因家族4、编码产物具有小段保守基序：有些基因家族中各成员的DNA序列可能不明显相关，而所编码的产物却有共同的功能特征，存在小段保守的氨基酸基序。基因超家族（gene superfamily) 指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族，它们的结构有不同的同源性，但功能并不一定相同。如免疫球蛋白基因超家族。真核基因的断裂结构断裂基因（split gene) 基因与基因间的非编码序列为间隔DNA（ spacer DNA).内含子（intron）无编码意义的DNA片段外显子（extron）具有

3、编码意义的DNA片段Chapter2 叶绿体基因组本章应掌握的基本概念叶绿体DNA的信息含量；叶绿体基因组的结构；叶绿体基因的组成；（记忆每个大标题，了解就可以了）叶绿体基因的一些结构特征。 p33. RNA编辑Chapter3线粒体基因组本章应掌握的基本概念线粒体基因组的大小；线粒体基因组的组织结构；线粒体基因组的组成；线粒体基因(jyn)的一些特征；p44. RNA编辑(binj)；（注意概念(ginin)，分类，意义）遗传信息在基因组之间的流动。（适当关注） Chapter4可移位遗传因子本章应掌握的基本概念可移位因子的类型；转座子；LTR逆转录转座子；无LTR逆转录转座子；转位因子(t

4、ransposable element) 可移动的基因成分，指能在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的片段。在细菌中可指在质粒和染色体之间或在质粒和质粒之间移动的片段。转位因子的主要类型插入序列（insertion sequence,IS)转座子（transposon,Tn)逆转录转座子（retroposons or retro transposon ）转座的噬菌体（transposable phage )插入序列(Insertion sequence) 一类简单转位因子，长度约7002000bp，由一个转位酶基因及两侧的反向重复序列（inverted repeat sequence,

5、 IR)组成，不带任何其它基因。转位时复制宿主靶位点一小段DNA（415bp）形成两端的正向重复序列。转座子（transposon,Tn) 一类较大的可移动成分。除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关并决定宿主菌遗传性状的基因。转座子中的转位酶常称为转座酶，其功能是介导转座子插入到DNA的其它部位。转座子与基因表达的关系：插入编码区，插入5侧向序列，可在不同植物中起作用1984年McClintock（巴巴拉麦克林托克）就提出转座子在植物基因组的重建中起着很重要的作用。转座子在调节和编码区域的插入和切除都能改变基因的编码功能和表达模式，但在抗病基因分子生物学的研究中，尚未有证据直接证明抗

6、病基因座中新的专化性抗性基因的产生是由转座子的插入或切除所致。不过已有试验表明，由转座子诱发的基因改变能引起抗病基因的失活和多样化。转座子通常会造成破坏，而在本例中，它们看来对寄主有利。加州大学戴维斯分校进化遗传学家 和同事 偶然间发现果蝇加州种群体内有一条含万个碱基对的染色体片段，所包含的全部基因不存在个体差异。原因可能是该相同区域中某个特别的等位基因迅速扩散到了整个种群，同时捎带上它附近的各等位基因基因，它与一个“跳跃基因”相连，负责清除杀虫剂和其他毒物的毒性。试验表明，当转座子存在时，基因比较活跃，这可能是由于跳跃过程打开了某个“基因开关”，而基因通常是处于关闭状态的。逆转录转座子（re

7、troposons or retrotransposon ）： 逆转录转座子又称“反转(fn zhun)位子”。这些流动(lidng)的遗传元素首先被转录成RNA，然后再被由该反转位子本身产生的一种逆向(n xin)转录酶重新转变成DNA。该DNA版本可在任何位置结合进基因组中。LTR逆转录转座子 p58：在结构、转录特性和转座机制上十分类似于逆转录病毒的原病毒，在其两端具有长的同相重复序列（LTRs）无LTR逆转录转座子 p63：有与逆转录转座子类似的序列结构，但两端缺少长的同相重复序列。典型的例子是长散布元件（long interspersed element，LINE）转座的噬菌体（tr

8、ansposable phage ) ：具有转座功能的溶源性噬菌体Chapter5 核酸的分子操作5.1 限制性内切酶概念、分类、性质（做一般性的了解）限制性内切酶：一类能识别双链DNA中短的特定碱基序列，并在序列内或旁侧一定距离内特异切割双链DNA的核酸水解酶。是体外剪切DNA的重要工具。分为I，II，III型同裂酶：两种酶的识别核苷酸顺序和切割位点都相同，它的区别只是在于，当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种可以切割，而另一种不能切割。同尾酶：两种酶的识别序列不完全相同，但是切割后产生的粘性末端是相同的。限制性内切酶酶促反应的条件（需要注意）1DNA的纯度2DNA的甲基化程度3酶切的反应温

9、度，一般为374DNA的分子结构5溶液中的离子强度核种类6缓冲液的ph值星活性（star act）：当条件改变时，可能改变酶切识别序列的专一性，这种酶切特异性降低的现象称为星活性或星号活性引起星活性的因素1. 甘油的浓度过高 5%2. 酶过量 100单位/ug3. 低离子(lz)强度 8.05. 有机溶剂,如乙醇(y chn)，乙二醇等6. 用其他(qt)阳离子代替Mg离子避免星活性的方法相应有：减少酶的用量，降低甘油浓度，提高离子强度，保证反正体系中没有有机溶剂，降低ph值，用Mg离子做二价阳离子。5.2 操作和标记核酸的酶（了解）5.3 核酸分子杂交技术概念：具有互补序列的两条核酸单链在一

10、定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。核酸分子杂交的基本原理: DNA变性和复性或杂交(hybridization)影响杂交的因素1核酸分子的浓度和长度：浓度大，复性快；分子量大，复性慢2温度3离子强度4杂交液中的甲酰胺5核酸分子的复杂性6非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA分子杂交的基本方法Southern 印迹法：DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Northern 印迹法：检测RNA（主要是mRNA）的方法斑点印迹杂交：将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上。优点：简单、快速、可同时检测多个样品原位杂交：将

11、标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。Western 印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法液相杂交Chapter6 分子克隆本章应掌握作为受体细胞的大肠杆菌；由质粒衍生的载体；由噬菌体衍生的载体；粘粒载体；单链丝状噬菌体M13载体；外源DNA与载体重组；重组(zhn z)DNA导入受体细胞；阳性(yngxng)重组体的筛选和鉴定。 本章涉及(shj)的主要概念基因克隆: 利用重组DNA技术分离目的基因克隆: 动词：指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程名词：指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群

12、遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。基因文库：由大量含有特定基因的不同DNA片段的克隆所构成的群体，分为基因组文库和cDNA文库基因文库的构建：如果构建基因组文库，首先提取基因组DNA，随机打断，打断的方法有物理和生物方法，物理方法是超声波粉碎（主要使用的方法），生物方法是酶切，然后用这些片段构建质粒，转化并表达于大肠杆菌，得到大量的克隆。再将得到的序列进行测序，测序完成后就建成了基因文库。对于文库中的每一个克隆它的序列都是已知的。cDNA文库的构建基本相似，先提取mRNA，然后反转录得到cDNA，打断，装入质粒，大量表达，最后测序。载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞

13、（host cell）的工具称为载体载体应具备以下特点：1. 在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；2. 必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；有一定的选择标记，用于筛选；有一定的拷贝数，便于制备。附加因素：MSC，LacZ（-互补），ssDNA， phage，origin，Promoter以及cos位点等。载体的类型 质粒（plasmid）、噬菌体（phage）、粘粒载体（cosmid，又称柯斯质粒）、噬菌粒（phagemid）第一节 质粒载体（Plasmid vectors）一、质粒的基本特性1概念: 染色体外的遗传因子，能进行自我复制(但依赖于宿主编码的

14、酶和蛋白质）;大多数为双链、闭合环壮DNA分子，少数为线性;大小1kb20kb，也有更大的（200kb)2质粒的表型：抗抗菌素、抗重金属、产生抗菌素、产生大肠杆菌素、产生溶血素、产生肠毒素、产生硫化氢、降解芳香族化合物、诱发植物肿瘤、糖发酵、产生限制酶和修饰酶3质粒的拷贝数：严紧型：拷贝数有限，大约1几个；松弛型：拷贝数较多，几十至几百4质粒的不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，微小差异，最终放大。5转移性：在自然条件下，很多质粒可以通过(tnggu)称为细菌接合

15、的作用转移到新宿主内。供体和受体细胞通过(tnggu)供体细胞表面的纤毛接触，然后一个质粒拷贝通过该纤毛进入受体细胞F质粒：又叫F因子(ynz)，即致育因子（fertility factor)的简称，为细菌的游离基因，在细菌的结合中使细菌能够起雄性的作用。雄性细菌充当一个DNA供体并产生F性须，通过F性须DNA被转移到受体的雌性细胞。二、标记基因 （做一般性了解）（1）氨苄青霉素抗性基因（AmpR ampr ampicillin）青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。（2）四环素抗性基因（tetr tetracycline）与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，

16、从而抑制核糖体的转位（3）氯霉素抗性基因（chloramphenicol, Cmr or Cat）Cm与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycinneomycin）可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氮基糖苷-互补（complementation）p90. Lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。用做筛选标记MCS（Multiple cloning sites）多克隆位点：人工构建的，紧密排列的具有多种限制酶识别序列的一段DNA序列，可方便的用于外源DNA片段的插入。限

17、制酶谱筛选转化后挑取许多独立的细菌菌落少量培养并提取质粒根据克隆片段和插入载体的位点，选择合适的限制酶进行酶切凝胶电泳分析限制酶图谱，从而选出阳性克隆表达筛选构建表达载体（含高效启动子）鉴定表达产物蛋白质的分子大小还可利用抗体进行筛选核酸探针筛选 根据核酸序列的同源性，利用核酸探针与转化后宿主细胞中的质粒杂交，可筛选出重组的质粒。这种方法多用于大量筛选天然质粒用作克隆载体的局限性1分子量较大，不便于操作2拷贝数较低，不利于质粒DNA的制备3抗菌素抗性基因(jyn)少，不便于选择4单一的限制性酶切位点少，且不集中，不利于基因(jyn)克隆质粒载体应具备(jbi)的基本条件 设法将一些克隆中常见的

18、有用性状组装进质粒载体，将天然质粒改造成理想的基因操作载体或适合于特定用途的载体。具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有若干限制酶单一识别位点，且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能具有较小的分子量和较高的拷贝数复制子（replicon）：能够自我复制，而且仅具有一个复制起点的DNA分子三、质粒载体的种类（一般了解）pBR322是最早人工构建的质粒1. 克隆载体：用于扩增或保存DNA片段，为最简单的载体。如pBR322 2. 表达载体基因的表达包括转录、翻译与翻译后加工、分离纯化等过程根据被表达的基因和表达基因所用的系统，可将表达分为：原核基因在原核细胞中表达真核基

19、因在原核细胞中表达原核基因在真核细胞中表达真核基因在真核细胞中表达原核表达系统主要有： E.coli系统 枯草杆菌系统真核表达系统主要有： 酵母细胞系统 哺乳动物细胞系统 昆虫细胞（杆状病毒）系统 高等植物系统克隆载体与表达载体的区别在原核克隆载体中通常都带一个松驰型复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。原核表达载体除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点、转录起始信号、转录终止信号、翻译起始密码子和终止密码子等一系列调控序列。 表达载体的选择非常重要，选择时主要应考虑下列因素：1. 所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。如果是天然蛋白，必须考

20、虑如何将目的基因准确地与载体衔接。如果是融合蛋白，则可以用三种不同阅读框架的载体使目的基因与载体序列吻合。2. 被表达的基因是原核基因还是真核基因。原核基因一般都带有核糖体结合位点，只需考虑它是否带有强启动子。对真核基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外，还须考虑该基因是否会产生(chnshng)翻译后加工，以后是否需要转到真核表达系统中表达等。核糖体结合位点(ribosome-bindingsite)又称SD序列(xli)(Shine-Dalgarno sequence)，它是指mRNA分子(fnz)中能与核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面312个碱基，该序列与16S r

21、RNA的3端互补。3. 表达蛋白是否分泌到体外。如需要分泌，则必须带有信号肽序列，故应选择带适当信号肽序列的载体。信号肽(signal peptide)又称前导肽(1eader peptide)，这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约1530个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出来。4. 所产生的融合蛋白是否需要切割加工及如何切割加工。对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体序列间应有适当的切割识别序列。 5. 是否需要用强启动子提高表达水平。当需要提高表达水平时，可选用强启动子。但在某些情况下，由于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不利，可选用诱

22、导型载体，只有经诱导后，蛋白质才能被表达。表达融合蛋白的优点以E.coli基因与外源目的蛋白基因组成融合基因产生的融合蛋白，可用作抗原产生抗体，然后用这种抗体测定或分离天然的目的蛋白。融合蛋白有下列优点：1. 转录和翻译起始从正常的E.coli序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。2. 融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。 3. 产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。4. 有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。真核基因的表达载体对表达真核基因，除了启动子外，还需要有一个有效

23、的核糖体结合位点。因为只有当被转录的mRNA与核糖体结合后，mRNA才能被有效地翻译。真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。因此需要用人工合成的转接头、人工合成的DNA引物或用DNA切割修补等方法使真核基因与载体的序列完全吻合。 分泌型表达载体有时为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解，或为使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体。分泌(fnm)型载体的优点1一些在胞内被蛋白酶降解(jin ji)的蛋白质在周质中很稳定。2一些(yxi)在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠 。3

24、产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。分泌型载体的缺点1目的蛋白质的产量往往很低，2信号肽不能被切除或切在错误位置。提高原核细胞中外源基因表达效率的措施1以融合蛋白表达目的蛋白提高融合蛋白的稳定性和产量。 2使用强启动子提高mRNA产量，并在基因下游加入稳定mRNA的强转录终止子，防止转录过度。3调整SD序列与ATG间的距离。SD序列与ATG的距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响蛋白质合成会相差2,000倍以上。应该在目的基因ATG上游 100bp左右开始，用酶切形成不同长度的片段，与带启动子和SD序列的载

25、体连接后，产生一系列重组DNA。从中选择产生高水平天然目的蛋白的重组体。 4利用蛋白酶缺陷型的宿主，例如用lon营养缺陷型减少外源蛋白的降解。5在宿主内表达蛋白酶抑制产物，从而抑制蛋白酶活性。6使蛋白质分泌到体外，减少反馈抑制或蛋白酶降解。7调整带目的基因的表达质粒的拷贝数，增加模板数。 8利用诱导物进行表达。过早地大量表达外源基因往往影响宿主细胞的繁殖，因此当不表达时，可使宿主细胞迅速繁殖生长得到较大的生物量，然后利用诱导物诱导目的基因表达。9人工合成目的基因，在不改变蛋白质氨基酸的前提下，根据简并性，利用宿主偏爱的密码子改变部分碱基序列。10定点诱变，消除核糖体结合位点附近可能的二级结构，

26、这种二级结构会影响翻译起始效率。外源DNA与载体重组粘性末端连接：连接效率高若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插

27、入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用小肠碱性磷酸酶(CIP)去掉载体5-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为EcoR I ，另一端为BamH I，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。平端连接(linji)：连接(linji)效率低待插入片段的平末端主要由两方面(fngmin)来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没

28、有互补的末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除3突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率 。一端是粘性末端，另一端是平末端连接不需要去磷酸化。作连接用的基因片段要纯化，量大一点，感受态做好一点。 只是通常连接时间会长一点（过夜好一点），用比较浓的酶。 重组DNA导入宿主 要注意的几个名词：转化 转导 转染 感染 结合转化（transformation）： 即一来自一个细菌细胞(供体)DNA(片段)被另一个细胞(

29、受体)所吸收(随后同受体染色体一起进行重组)感受态细胞（competent cell）：能够吸收DNA的细胞转导 (transduction)：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程或者说由噬菌体将细菌基因由一个细菌(供体)转移到另一个细菌(受体)的过程。转染 (transfection)：感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸感染,随后能产生出正常噬菌体后代或者说真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。感染 (infection)：病原微生物在寄主组织内立足的状态目的基因的筛选和鉴定(screening/selection)1遗传学方法插入灭活法(insertion ina

30、ctivation):抗药性标志选择标志补救：表达产物与营养缺陷互补。包括- 互补、蓝白斑筛选 2免疫学方法3分子杂交探针-原位杂交4PCR限制性酶切图谱 第七章 DNA序列测定与分析测序策略Sanger双脱氧(tu yng)链终止法Maxam-Gilbert化学(huxu)直读法杂交(zjio)测序与DNA芯片技术ESTDNA序列分析DNA序列测定的几个支撑技术Sanger双脱氧末端终止法；PCR技术；DNA自动测序仪的发展；生物信息学分析软硬件设施大规模基因组测序的两种策略逐步克隆法（Clone by Clone）基因组DNABAC文库根据物理图谱正确定位的BAC 或contig用于霰弹法

31、测序的候选克隆用于霰弹法测序的亚克隆测序并组装完整的基因组序列全基因组霰弹法（Whole Genome Shot-gun)又叫鸟枪法基因组DNA霰弹法克隆测序并进行全基因组序列组装完整的基因组序列两种大规模基因组测序策略的比较 项 目策 略全基因组霰弹法逐步克隆法遗传背景不需要需要（需构建精确的物理图）谱）速度快慢费用低高计算机性能高（以全基因组为单位进行）拼接）低（以BAC为单位进行拼接）适用范围工作框架图精细图代表测序物种果蝇、拟南芥、水稻人、线虫物理图谱的构建 （不是重点）大规模表达序列标签(EST)测定及分析p120.需要掌握：1、什么是EST?2、EST的应用 3、EST序列测定及分

32、析过程ESTs（Expressed Sequence tags ）：是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5末端或3末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。EST的应用：1ESTs与基因识别ESTs已经被广泛的应用于基因识别，因为ESTs的数目比GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人员更容易在EST库中搜寻到新的基因(Boguski et al., 1994). 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。 在不同物种间搜寻功能相同(xin tn)的基因(orthologs)。 已知基因的不同(b tn)剪切模式的搜寻。2

33、ESTs与基因图谱的绘制(huzh) EST可以借助于序列标签位点(sequence-tagged sites)用于基因图谱的构建. STS本身是从人类基因组中随机选择出来的长度在200-300bp左右的经PCR检测的基因组中唯一的一段序列。来自mRNA的3非翻译区的ESTs更适合做为STSs，用于基因图谱的绘制。其优点主要包括： 由于没有内含子的存在，因此在cDNA及基因组模板中其PCR产物的大小相同； 与编码区具有很强的保守性不同，3UTRs序列的保守性较差，因此很容易将单个基因与编码序列关系非常紧密的相似基因家族成员分开。 （James Sikela等，1991年）3ESTs与基因预测

34、由于EST来源于cDNA，因此每一条EST均代表了文库建立时所采样品特定发育时期和生理状态下的一个基因的部分序列。使用合适的比对参数，大于90的已经注释的基因都能在EST库中检测到(Bailey et al., 1998)。ESTs可以做为其它基因预测算法的补充，因为它们对预测基因的交替剪切和3 非翻译区很有效。4ESTs与SNPs来自不同个体的冗余的ESTs可用于发现基因组中转录区域存在的SNPs。最近的许多研究都证明对ESTs数据的分析可以发现基因相关的SNPs (Buetow et al., 1999;Garg et al., 1999; Marth et al., 1999; Pico

35、ult-Newberg et al., 1999) 。应注意区别真正的SNPs和由于测序错误( ESTs为单向测序得来，错误率可达2)而引起的本身不存在的SNPs。解决这一问题可以通过： 提高ESTs分析的准确性。 对所发现的SNPs进行实验验证。5利用ESTs大规模分析基因表达水平 因为EST序列是从某以特定的组织的cDNA文库中随机测序而得到，所以可以用利用未经标准化和差减杂交的cDNA文库EST分析特定组织的基因表达谱。标准化的cDNA文库和经过差减杂交的cDNA文库则不能反应基因表达的水平。ESTs数据的不足1ESTs很短，没有给出完整的表达序列2低丰度表达基因不易获得3由于只是一轮测

36、序结果，出错率达2%-5%4有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或是基因组DNA的污染5有时出现镶嵌克隆6序列的冗余，导致所需要处理的数据量很大Chapter 8聚合酶链式反应(lin sh fn yng)(PCR)本章应掌握(zhngw)的内容PCR的基本原理；PCR条件(tiojin)的优化；由基本PCR拓展的相关技术及其应用 多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。PCR引物设计的重要性决定着扩增的特异性和扩增的效率。设计影响到后续载体构建的效率设计影响到实验的成本引物设计原则：主要考虑

37、长度，顺序，碱基组成，二级结构，对3-端的要求，对5-端的要求， Tm值PCR引物的寡核苷酸数（长度）一般在1630个核苷酸（NT），至少为16个核苷酸，最好为2024个核苷酸 。（以上指与模板链完全配对的碱基数）太短，特异性差；太长，自身折叠形成二级结构，Tm过高，不利于与模板稳固配对，难以形成扩增起始二级结构。引物顺序应是所要扩增基因特异的顺序，若要进行个体间的比较，应选择保守同一的顺序来设计引物，设计后用电脑DNA数据库检测同源性。 引物的碱基组成GC为4060，ATGC最好随机分布。GC太少扩增效果不佳，GC过多易出现非特异条带，避免成串的嘌呤和嘧啶。引物中的二级结构一对引物的顺序不应

38、自身互补，特别要避免3-端的重叠，以免形成二聚体等特异的扩增条带。对3-端的要求3-端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格配对。若3端最末的碱基不肯定，可用次黄嘌呤核苷取代的引物，因为 I 可与ATGC配对，这样可避免因末端碱基不配对而造成PCR失败。防止3-末端发卡结构 、茎环结构 ！对5-端的要求5-端可附加一段与模板非互补的序列，可长至45NT，而不影响扩增，这点对研究基因结构与功能很有用。一般在引物的5-端可加入限制酶位点序列，以便进行克隆。在酶切位点5-端还应加上适当数量的保护碱基极（如GCGC和GGCC），以保证扩增反应产物克隆后能够被酶切。设计5-端的RE位点序列是最费时的

39、！功能基因起始密码（ATG）5-端前应加入的序列（Kozak序列）。动物功能基因前加入序列：CCACCATG；植物功能基因前加入序列：AACAATG引物的Tm值（扩增特异(ty)基因，Tm一般选4060）1反应体系对引物退火温度(wnd)的影响。如酶的最适工作温度对引物退火温度的限制等。太低，引物与模板非特异结合，出现(chxin)非特异扩增条带。太高，引物与模板结合不牢固，无扩增。2扩增产物的Tm值。引物和产物的Tm值不要相差太大，20范围内较好。定下引物的Tm值范围之后，即可定下引物的长度范围PCR条件的优化（常见问题分析与对策） 假阴性：不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有:模板核酸的

40、制备，引物的质量与特异性，酶的质量及， PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板： 模板中含有杂蛋白质，模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。 酶失活： 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物： 引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败

41、或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单 位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存(bocn)，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计(shj)不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度(nngd)：

42、Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特 异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变： 通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。 物理原因： 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下

43、扩增仪的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。 靶序列变异： 如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。 二、假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。 引物设计不合适： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。 靶序列或扩增产物的交叉污染： 这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决： 操作时应小心轻柔，防

44、止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩 增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。 出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低

45、，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策(duc)有：必要时重新(chngxn)设计引物。减低酶量或调换(diohun)另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。

46、增加模板量，减少循环次数。Chapter 9 DNA分子标记技术 大纲要求基于Southern杂交技术的分子标记: RFLP，VNTRs基于PCR技术的分子标记: 随机引物分子标记技术RAPD，AFLP，SSR/STR分子标记的应用领域 遗传标记遗传标记主要分为形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA 分子标记4 种类型.理想的遗传标记应具备多态性高、遗传稳定、遗传行为简单、能检测整个基因组、不受内外环境影响、操作经济简单等基本特征. DNA 分子标记： DNA 标记是DNA 水平上遗传变异的直接反映,最能稳定遗传且信息量大,许多多态性标记在非编码区表现选择“中性”,不受内外环境影响,与基因表

47、达与否无关,检测迅速,操作也方便。由此可见,DNA 分子标记是最理想的遗传标记。依多态性检测手段可分为：以Southern 杂交技术为核心的分子标记和以PCR 技术为核心的分子标记限制性片段多态性( Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP)这是第一个被应用于遗传研究的DNA 分子标记技术。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA 分子中特定的位点,如果因碱基的突变、插入或缺失,或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生,用限制性内切酶消化基因组DNA 后,将产生长短、种类、数目不同的限制性片段,这些片

48、段经电泳分离后,在聚丙烯酰胺凝胶上呈现不同的带状分布,通过与克隆的DNA 探针进行Sourthern 杂交和放射自显影后,即可产生和获得反映生物个体或群体特异性的RFLP 图谱。 探针的来源(liyun)主要是cDNA 克隆(k ln),其中(qzhng)cDNA探针保守性较强,许多同科物种cDNA 探针都可以作为通用探针.RFLP 分析技术路线小分子DNA ,如细胞器基因,将纯化的DNA 样品用限制性内切酶消化成长度不等的片段进行琼脂糖凝胶电泳分离,经溴化乙锭染色后在紫外光下直接观察其多态性。大分子核DNA 需要借助分子杂交手段,用某一标记DNA 片段的探针与被转移到硝酸纤维薄膜上的DNA

49、片段进行杂交,只有与探针有高度同源性的片段被检测出来。RFLP 的优点 ：呈孟德尔遗传;不受环境影响,是一种共显性标记, 结果稳定可靠,重复性好。共显性（codominance）：在杂合子状态下，两个基因的作用都表现出来。缺点RFLP 需要大量的DNA ,样品要求高。多态性频率较低。判读有一定困难。实验室之间结果比较有一定困难。制备放射性探针进行Southern 杂交,因而比较费时,对人体健康有影响,对环境有污染 RFLP应用适用于构建表达图谱。分析群体内和群体间遗传变异度。群体间基因流评价和亲缘关系时是强有利的评价。也可用于人类遗传疾病的诊断。随机扩增片段长度多态性标记(Random Amp

50、lified Polymorphic DNA ,RAPD) 1990 年由美国杜邦公司农产品研究中心的Williams 等用任意顺序的10 个碱基的寡核苷酸片断作为引物,用未知序列的基因组DNA 为模板,通过PCR 扩增获得一组不连续的DNA 片段，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 序列多态性.并将此法命名为RAPD。 RAPD 技术与PCR 技术相比较 RAPD 反应一般由1 个10寡核苷酸随机引物,常规PCR 需用2 个20 bp 左右的特定设计引物; RAPD 反应退火温度低,一般是36 左右,一方面保证引物与模板DNA 的稳定配对,同时允许适当错误配对,提高多态性检出率; 常规PCR 为特

51、异扩增,而RAPD 产物为随机扩增. RAPD 技术路线 采用随机序列10个核苷酸引物对基因组进行PCR 扩增,非特异引物可结合模板DNA 的多个位点,产生多个条带,经电泳分离,或EB 染色,可直接检测DNA多态性,并用于DNA 指纹分析. RAPD 的优点 1引物设计是随机的, 故可在对各种生物没有任何分子生物学研究的情况下,对其进行DNA 多态性分析。2所需模板DNA 的量极少, 只要有特定的DNA 片段, 就可将该DNA 片段扩增。3引物为人工合成, 通常一套引物可用于多物种的基因组DNA 多态性分析。4每个RA PD 标记就相当于一个(y )靶序列位点(Sequence Tagged

52、Sites) , 可以(ky)检测出RFLP标记不能检测的重复(chngf)顺序,可填补RFL P图谱空缺, 更有效地进行遗传图谱的构建。5绝大多数RA PD标记遵从孟德尔遗传规律。 RAPD 技术的局限性 1由于随机引物较短,退火温度低,因而对一些PCR 因素更敏感,重复性较差。一般来说,对于特定的仪器设备,对其反应条件反复进行优化,才可以得到较可靠的结果。2分辨率低。3结果不全是共显性。4无法分析差异原因。应用1尽管RAPD 技术诞生的时间很短,但由于其独到的快速、简便的检测DNA 多态性的方式,使这些技术已渗透于基因组研究的各个方面,在分子生物学的各个领域的研究中具有广泛的应用前景。2适

53、用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究,也可用于亲缘关系等的研究扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism ,AFLP) 既有RFLP 的可靠性,又有RAPD 的方便性基本原理 在AFL P 中,如果DNA 片段遗传特性发生改变,则酶切片段数目、长短发生变化,通过PCR 扩增基因组DNA 片段,扩增产物多态性就反映在变性聚丙烯酰胺电泳的图谱上其中引物= 接头+ 酶切位点+ 23 个核苷酸. AFLP 技术分析流程 1DNA 模板制备。2提取样本DNA 经浓度和质量检测后,一般采用双酶切, 在基因组DNA 上

54、产生低频和高频切口。3选择性扩增酶切片段. 酶切后,限制性片段在T4 连接酶作用下与特定接头连接,形成带有接头的特异性片段。4PCR 前扩增,一般用带一个选择性引物进行预扩增反应条件与常规PCR反应基本一致; 5利用放射性同位素标记或荧光标记PCR 引物。在Taq聚合酶作用下完成94变性30 s ,65淬火30 s ,72 延伸60 s ,PCR 扩增36 个循环。 6PCR产物在含尿素聚丙烯酰胺上电泳。7将电泳后的凝胶转移到吸附滤纸上,经干胶仪进行干胶处理。 8在X 光片上感光,数日后冲洗胶片并进行结果分析。优点所需DNA 少(仅需0. 5 微克) ,也可以作用于线粒体DNA。从线粒体中得到

55、RFL P研究所需的几十到上百微克mDNA 是很困难的。Rosendahl 和Taylor 成功地从mycorrhizal 菌单孢子中获得了AFL P 标记,而每个单孢子仅产生约0. 10. 5gDNA；效率高且简单,RFLP 每次只能分析已知少数几个位点,而AFL P呈典型的孟德尔式遗传,每个AFL P 可以获得50100 条谱带信息,多态性强；分辨率高。AFL P扩增片段短,片段多态性检出率高,而RFL P 片段相对较大,内部多态性往往被掩盖；可靠性好。AFL P 由于是特定引物扩增,退火温度高 (一般65 ) ,只有那些与3端严格配对的片段才能得到扩增,选择性很强.因而假阳性低,重复性好

56、,克服了RAPD 缺点。Jones 等在欧洲8 个实验室,使用共同的样本,进行了严格的实验,将得到的DNA 图谱比较,172 条谱带中仅一条出错。这就是说,实验室间的误差要少于6 %；不需要Southern 杂交,不需要预先知道DNA 的序列信息。而且,已经发现在所有的多态AFLP 标记中, 共显性的AFLP 标记出现频率为4 %15 %,即200 个多态标记包括530 个基因座位；李传友等(2000) 将AFLP 标记和RFLP ,RAPD 标记进行比较,认为它们鉴别多态的功效是AFLP RAPD RFLP。 AFLP的应用(yngyng) 1在生物(shngw)多样性中将AFLP广泛应用到

57、那些无法通过形态特征区别的分子标记解决的家系或近缘物种(wzhng)与系统发生关系研究中,是生物多样性调查的重要工具。2构建遗传图谱。3AFLP还可应用于基因定位和性别鉴定及繁殖行为研究中。AFLP的不足 1不是共显性标记,扩增片段少数是共显性条带,多数是扩增片段有/ 无显性条带,条带统计分析难度较大。2标记引物需要同位素或其它化学试剂,相对费时。3对操作人员的实验技术水平要求较高。4对模板DNA的质量要求较高,且需模板DNA量多于2g 。 微卫星(Microsatellite) ：以几个(16 bp)核苷酸为单位,多次串联重复序列,也称之为简单重复序列(single sequence rep

58、eats ,SSR) 、短串联重复序列(short tandem repeats ,STR) 或简单序列长度多态性(single sequence length polymorphism ,SSLP) 。小卫星DNA： 是一些重复单位在11 - 60bp ,重复次数在成百以上,总长度由几百至几千个碱基组成的串联重复序列,主要分布于染色体近端粒区和着丝粒区根据微卫星自身结构又将微卫星分为完全、不完全、复合微卫星。完全微卫星由不中断的重复单位串联而成,不完全微卫星是指重复单位间有3 个以下的非重复碱基间隔,且两间隔间重复单位连续重复数不低于3 ,复合微卫星由几类串联重复单位构成,中间有3 个以下碱

59、基间隔,且两间隔间重复单位连续重复数不低于5。 原理研究发现微卫星由侧翼序列将核心序列特异地定位于染色体,该侧翼序列在物种间具有较高同源性,因此,可以根据微卫星两端的侧翼序列设计引物,进行PCR 扩增以获得微卫星DNA 指纹图谱。由于微卫星核心序列分布于结构基因侧翼或内含子中,因此,它承受的选择压力较小,在物种进化过程中积累了丰富的变异,从而决定了微卫星的多态性较高,其多态信息含量(PIC) 值在0. 7 以上,加上该技术稳定可靠,操作程序相对简化,因此被认为是一种很有应用价值的遗传标记技术。 SSR 分子(fnz)标记一般程序 1微卫星序列(xli)的获得:包括(boku)构建基因组文库,根

60、据欲得到的SSR 类型,设计合成寡核苷酸探针,通过菌落原位杂交筛选所需的重组克隆,对阳性克隆进行顺序鉴定. 2微卫星引物设计:由于微卫星两侧序列具高度专一性,因此据此设计引物用以扩增同一物种甚至不同物种的其它基因型片段. 微卫星引物在基因组中具有高度专一性,每一条引物长1824 bp , ( G+ C) 百分含量接近50 %( Tm60 左右) . 3PCR 扩增:以待研究的核DNA 为模板,用合成引物进行PCR 扩增. 扩增时需掺入同位素或其它放射性标记,以便对扩增产物进行分析. 4对扩增产物进行检测:扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶干燥后通过放射性自显影显示结果,根据胶片上的条带分布