基因工程外源基因的工程表达_第1页
基因工程外源基因的工程表达_第2页
基因工程外源基因的工程表达_第3页
基因工程外源基因的工程表达_第4页
基因工程外源基因的工程表达_第5页
已阅读5页,还剩64页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、外源基因的工程表达基因工程技术的核心是基因表达技术。基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达。基因表达在原核生物与真核生物中的差别外源基因的起始转录mRNA的延伸与稳定外源基因mRNA的有效翻译表达蛋白在细胞中的稳定性第一节 外源基因表达的机制1、外源基因的起始转录 外源基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的限速步骤。原核生物启动子诱导型启动子:组成型启动子:如lac、trp等的启动子如T7噬菌体的启动子2、mRNA的延伸与稳定外源基因起始转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。防止因转录提前终止存在正常的转录终止序列3

2、、外源基因mRNA的有效翻译外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则:ATG起始密码子。SD序列在翻译起始区周围序列不易形成明显的二级结构。密码子的选择性主密码子 (major codon)罕用密码子(rare codon)脯氨酸 CCA CCT CCC(大肠杆菌) CCG(人)4、表达蛋白在细胞中的稳定性4.1 避免外源基因表达蛋白降解的对策:构建融合蛋白表达系统构建分泌蛋白表达系统构建包涵体表达系统选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统第二节 外源基因表达系统外源基因表达系统:泛指目的基因与表达载体重组后,导入合适的受体细胞,并能在其中有效表达,产生目的基因产物(目的蛋白)。外源基因表达系统

3、基因表达载体受体细胞基因表达系统原核生物基因表达系统真核生物基因表达系统(一)大肠杆菌基因表达载体1、大肠杆菌基因表达载体DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统(1)DNA复制及重组载体的选择系统1.1 复制子常见的复制子松弛复制型,每细胞质粒拷贝数1020个。严谨复制型,每细胞质粒拷贝数少于5个。1.2 选择标记微生物表型选择标记显性标记营养缺陷型标记(2)外源目的基因的转录系统这一系统包括启动子、抑制物基因和转录终止子。抑制物基因(3)蛋白质的翻译系统3.1 核糖体结合位点(SD序列)3.2 翻译起始密码子3.3 翻译终止密码子由于UAA同时为两个释放因子所识

4、别,一般被选作翻译的终止密码。起始密码子是翻译的起始位点,通常为AUG(ATG),编码甲硫氨酸(MET),是首选的起始密码子。3.1 核糖体结合位点影响翻译的因素核糖体与mRNA的结合程度大肠杆菌SD序列的碱基组成为5 -AGGAGG -3SD序列与起始密码子之间的距离SD序列与起始密码子之间的碱基组成(4)常见的大肠杆菌表达系统Lac和Tac表达系统:是以lac操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。PL和PR表达系统:是以噬菌体早期转录启动子PL和PR构建的。T7表达系统:是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达系统。4.1 Lac和Tac表达系统由启动子Plac + 操纵基因la

5、cO + 外源基因组成。Tac=Trp(-35)+PlacLacI PLac4.2 PL和PR表达系统噬菌体转录启动子PL、PR 构建的载体,这两个强启动子受控于噬菌体cI基因产物。cI基因的温度敏感突变体cI857(ts)常常被用于调控PL、PR 启动子的转录。同样也是30度下阻遏启动子转录,42度下解除抑制开始转录。PL/PRcI857(ts)4.3 T7表达系统T7噬箘体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬箘体启动子的转录。受体菌通常为E.coli.BL21(DE3)(4) 外源基因的表达形式(一)不溶性蛋白-包涵体蛋白1. 包涵体:在一定条件下,外源基因的表达产物在大肠杆菌中

6、积累并致密地集中在一起形成无膜的裸露结构,这种结构称为包涵体。2. 包涵体存在部位:细胞质、细胞周质3.包涵体的组成蛋白质非蛋白质外源基因的表达产物:占大部分,具有正确的氨基酸序列,但空间构相错误,因而包涵体蛋白一般没有生物学活性。受体细胞本身的表达产物:如RNA聚合酶、核糖核蛋白、外膜蛋白以及表达载体编码的蛋白等。:包括DNA、RNA和脂多糖等。4.包涵体形成的本质 是细胞内蛋白质的不断聚集,主要包括三个方面:折叠状态的蛋白质的聚集作用;非折叠状态的蛋白质的聚集作用;蛋白质折叠中间体的作用。5. 形成包涵体的原因基因工程菌的表达产率过高重组蛋白的氨基酸组成重组蛋白所处的温度与pH值重组蛋白是

7、大肠杆菌的异源蛋白6.包涵体纯化破菌: 1、机械破碎 2、超声破碎 3、化学方法破碎 4、溶菌酶处理分离: 离心:5000-20000g,15min离心,可使大多数包涵体沉淀,与可溶性蛋白分离。 洗涤: 通常用低浓度的变性剂如2M尿素洗涤,用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 溶解: 常用的变性剂有尿素(8M)、盐酸胍,通过离子间的相互作用,破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。7. 包涵体复性方法稀释复性透析复性超滤复性柱上复性(二)可溶性蛋白-融合蛋白融合蛋白将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起,但不改变两个基因的阅读框,以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。1.融合

8、蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点:可溶性状态存在表达效率高稳定性好较易于分离纯化2.融合表达的亲和纯化蛋白标签个子越小越好生理条件下带电越少越好 容易得到和天然蛋白相似的产物融合标签的免疫原性越少越好 融合产物不必除去标签可直接作为抗原免疫 2.1 His蛋白标签特点优势6组氨酸与Ni-NTA的结合是不受构象影响的在天然或变形的条件下进行一步纯化使用的是温和的洗脱液环境结合、洗涤和洗脱步骤不会对蛋白结构产生影响6组氨酸标签比普通的标签(Tag)要小得多纯化后蛋白可以直接进行下游操作6组氨酸可以用于任何表达系统,包括:细菌、杆状病毒和哺乳动物6组氨酸标签在生理溶液pH下不带电荷标签不会干

9、涉重组蛋白的结构和功能6组氨酸不会影响蛋白的分泌6组氨酸标签免疫原性差重组蛋白可以不需要除去标签直接作为抗原进行免疫利用Xa因子蛋白酶可以方便地将6组氨酸标签有效地切除去除标签的蛋白可以用作晶体成像或者核磁共振研究2.2 His蛋白标签类型N末端加入标签C末端加入标签顺式抑制载体多系统表达载体含有双标签载体2.3 GST融合表达系统表达融合蛋白物是在载体上接上了一种的谷胱甘肽转移酶基因。2.4 pGEX表达融合蛋白的优越性载体构建无需考虑SD及RBS序列由于载体自带LacI基因,对宿主无选择性蛋白纯化条件温和,有利于保持蛋白活性GST蛋白与目的蛋白分离简便(二)酵母基因表达载体酵母基因表达系统

10、的载体一般是一种穿梭质粒,能在酵母菌和大肠杆菌中进行复制。1. DNA复制起始区在大肠杆菌中复制的复制起始序列在酵母菌中引导进行自主复制的序列2. 选择标记营养缺陷型选择标记:它与宿主的基因型有关。3. 有丝分裂稳定区4. 表达盒表达盒由启动子、分泌信号序列和终止子等组成,是酵母表达载体的重要元件。第三节 外源基因表达产物的检测外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。检测特异性mRNA的方法Northern杂交法检测特异性蛋白质的方法报告基因的酶法检测免疫学检测法生物学活性检测法定量RT-PCR法一、外源基因转录产物的检测1. 定量RT-PCR技术 可以检测外源基因是否转

11、录出mRNA及mRNA表达水平PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系 一、外源基因转录产物的检测1. 定量RT-PCR技术1.1 荧光染料和荧光探针1.1.1 SYBR Green I一、外源基因转录产物的检测1. 定量RT-PCR技术1.1 荧光染料和荧光探针1.1.2 分子信标(molecular beacon)一、外源基因转录产物的检测1. 定量RT-PCR技术1.1 荧光探针和荧光染料 1.1.3 TaqMan 探针一、外源基因转录产物的检测1. 定量RT-PCR技术1.1 荧光探针和荧光染料 1.1.3 LUX Primers 一、外源基因转录产物的检测2. Northe

12、rn杂交技术 可以检测外源基因是否转录出mRNA。提取总RNA分离mRNA。制备DNA探针。Northern杂交。2.1 Northern杂交的步骤:Northern 杂交Southern杂交、报告基因的酶法检测报告基因必须具备两大特点:其表达产物及其功能在未转化的细胞中并不存在;其表达产物便于检测。二、外源基因蛋白产物的检测2008年度诺贝尔化学奖 下村修钱永健马丁查尔菲Beta桶状结构,直径30 高40 外部有11个反向平行的beta折叠(绿色)内部有alpha螺旋(亮蓝色)中心部有一个荧光基团(黄色)2.1.1 GFP(Green Fluorescent Protein)结构特点荧光稳定

13、检测方便无种属特异性,也没有细胞种类和位置的限制GFP 对受体细胞基本无毒害不受假阳性干扰。不需任何反应底物和辅助因子; 可制成永久标本。灵敏度高。2.1.2 GFP 用作标记蛋白具有的优点增强型GFP 荧光强度提高了35 倍人工GFP 适合在哺乳动物细胞中高效表达红移荧光蛋白 更适于普通荧光显微镜观察蓝色荧光蛋白可用作指示剂的GFP 突变型 如p H敏感GFP 被用来测量细胞器或更小颗粒 的p H ,并记录其变化。2.1.3 改进型GFP类型Application of AFPs for studying microbe-plant interactions. (a) Dual-labeli

14、ng experiment showing colonization of tomato roots by P. Fluorescens and P. chlororaphis (b) Visualization of Rhizobia in the infection thread during nodulation . Alfalfa seedlings were inoculated with mixed cultures of Sinorhizobium meliloti, labeled with GFP or DsRed, and the infection process obs

15、erved (d) Biocontrol interaction between fungi visualized with GFP.、免疫学检测免疫沉淀法放射免疫法Western杂交法Western印迹法流程蛋白质的提取SDS分离蛋白质蛋白质条带印迹探针制备杂交检测Western电转移装置Western印迹法流程蛋白质的提取SDS分离蛋白质蛋白质条带印迹探针制备杂交检测、表达产物生物学活性检测 第四节 基因表达产物的分离纯化一、基因表达产物分离纯化的步骤:细胞破碎离心分离柱层析电泳1、细胞的破碎细胞破碎方式变性剂裂解法超声波破碎法机械破碎法酶裂解法2、离心分离离心力一般在数万g范围以内,主要

16、用来去除未破碎的细胞和细胞壁碎片等;高速离心:超速离心:离心力一般100,000g以上,可用来去除细胞膜碎片等高分子复合物。附:离心力和转速的换算公式:RCF=11.18(N/1000)2rRCF:相对离心力,单位为重力加速度gN:转头旋转速度(转速),用r/min表示r:转头半径,为离心管中轴底部内壁到离心机转轴中心的距离,单位为厘米(cm)3、特异性表达蛋白的初步分离沉淀法:超滤浓缩法:根据蛋白质分子大小的不同而进行初步分离的一种方法。简便有效,能处理大量的样品、并除去大量的杂蛋白。常用硫酸氨或有机溶剂4、柱层析柱层析纯化蛋白质的步骤:装柱柱平衡上样洗脱分部收集检测5、聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE-半乳糖苷酶 ;乳酸菌;沙克乳杆菌细菌素 Figure 1. Schematic overview of the pEH plasmids used in this study.256rep: replication determinants; lacLM: structural gene; erythromy

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论