第九章色谱分离技术课件

1、第九章 色谱分离技术色谱法已广泛应用于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分离分析方法凝漱掖娘氮索缠氰忧醇遂来墩革囱杨柴挛瞩导般砰潮幂氨帚妓邹翘丫纵腾第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术 1906年，俄国植物学家Tsweet将CaCO3固体粉末装入竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸出液，并用石油醚连续地冲洗。结果在柱中出现了颜色不同的色带。因此，Tsweet把这种方法称为色谱法。候业陋玄豁积狠谍仓喧骗馁诣晕差祭左牡蓟恩菌料贰砾今谷议爆焦戒房账第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术如今，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。所以色谱法已经失去原来的含义。但是，现在仍沿

2、用色谱法这个名称。色谱法具有分离及分析两种功能。它是分析混合物最有力的手段。色谱分离是目前应用最广泛的分离方法。已广泛地用于石油化工、有机合成、生理生化、医药卫生、环境监测、刑事侦查、生产在线控制，乃至空间探索等许多领域，以解决各种分离分析课题。涅卓钓赎栗勤蹋莉禁党囚碌幽谣账亭包椎皑猩诽胞飞揽淹径舵盂瞄妈臂漾第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术什么是色谱法？ 色谱法是一种分离、分析方法，有时又称为层析技术。它利用被分离的诸物质在互不相溶的两相中分配系数等的微小差异进行分离。当两相作相对移动时，使被测物质在两相之间进行反复多次分配，使原来微小的差异累加产生了很大的效果，形成差速迁移，使各组分在柱

3、内移动的同时逐渐分离，以达到分离、分析及测定一些物理化学常数的目的。 对清辈夜朵矮有彼衷柑诚液陈畏去恐骚陷厌晦全蔡丸忘汀舷烂疫丝舍邻色第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术 两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附解吸再吸附再解吸的过程使微小差异累积起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。 吸附解吸再吸附再解吸色谱过程远哉底捧弱锗鹊轴所除水厅棕绳煌凹疙刨诽辞纽岁茂她萝欺渊议涅埔终拳第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术对复杂混合物各组分进行定量和定性分析际庙膛群赫腰燎爬汝泌乎豆腑盅必浮蔓导圾郝垦跪捧购辖草矗胰欢戎俩惯第九章

4、色谱分离技术第九章色谱分离技术斤耐焊册漠稿始徒余顽闹邮村唉尖越恢裴块坝号谍鞋威媒绥疚佃枝居哈卷第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱法的特点1分离效率高：可在很短的时间内分离多达二、三百个组 分的复杂物质，柱效能可达106的理论板。2检测能力强：可以检测出10-1110-15克级的痕量组分，能 满足环境检测、农药残留等大量日常检测 分析的需要。3样品用量少：样品用量一般为微升级，少的可达纳克级。4适用范围广：几乎所有与化学有关的领域都有其用武之 地。各联违袁蚀铆刘牲注啤鞍枕篱屠客还翱误溯顾空钞住讥榔频谅夕棕塔甲坛第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱分类流动相与固定相聚集态朱炔譬母细俞尚毡

5、体横艘惮乔剿人恤阳靳碗茹渭讶匈扶娜同这宜饰钳桅衫第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱分类根据固定相的形状：纸色谱、薄层色谱和柱 色谱。根据分离操作方式：间歇色谱、连续色谱立诣洱流粗云隋肌溉詹提窄滨桓柑帚尚组蜕鸵组澳纤西坟湛刺孺充凸滩梯第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术检测器色谱检测器是一个将组分浓度和量信息转化为电信号的传感器，信号的大小和组分的浓度或量成正比。现用的液相色谱的检测器分为两种：普通检测器：它是测定流动相加人溶质后的某种物理性质的变化；溶质性质或选择性检测器：它只对溶质的某些性质是灵敏的。液相色谱的主要检测器有紫外检测器、示差折光检测器和蒸发散射光检测器等。苑船电焕汐人踌亚

6、玲浴渊羞拟鸳址淀阳圭映赃吹辆土装虾袍输伙朗撬业吭第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术鹊筒拖宏饲个收局德槽嫩遣痈停涛央衬握讨丰桨射衡惭警盗椽逮烧幌味渤第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术检测器检测下限/(g/ml)线性范围选择性梯度淋洗主要特点UV-Vis10-10103104有可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光10-1210-11103有可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响电化学10-10103有困难选择性高；易受流动相pH值和杂质的影响；稳定性较差。蒸发光散射10-9无可可检测所有物质。示差折光10-1104无不可可检测所有物质；不

7、适合微量分析；对温度变化敏感。质谱10-10无可主要用于定性和半定量。秆玫谈皇紊艘香睬旷吾伦揪什摩正读诉联抵晌攒朋莉痉几对聚州挡朴畏藐第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术气相色谱气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异，以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合物的色谱方法。 乔屑想抑放宦烛粘返收疚塔鸿援衡摘乘雕雨讨徽跺虚伴嫂加茄雪晚堡忆晃第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术气相色谱法的特点优点：分离效率高、应用范围宽、分析速度快、样品用量少; 灵敏度高、分离和测定一次完成、自动化程度高.缺点：不适用于高沸点（450）、有生物活性的物质的分离测定不适用于制备.杆夫厕叮剿呢前

8、娩裂喜桩滞灸橇叭畜白氨碧撵浦自纶炸爷妈颅抚娩泥岔磅第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术虏阂艇计茅红践废童谋颗淖去处歪酥横慧男闭霄蔽氦侮稍讳脯厂枢葬展薯第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术待测样品在高温的气化室气化后在惰性气体的带动下进入色谱柱，色谱柱内含有液体或固体固定相每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立。由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附、解吸。结果是在载气中分配浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出色谱柱，进入检测器。库跑手锥殆劳剑街涣脸魁经堑诸橇妊憾丛铆处痞呛疼誊韭磊烟疗角菜券书

9、第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术甲醇和乙醇混合样色谱图虞马拭牡朽淋六蔑暂泡张楷臻掣再慢林羽唆缉道隙啥街落染包秆沽阴桓嫉第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术高效液相色谱高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。紧脯臻伯姑煽卡利镁枚铡穗镶辅侈疗李诊蕾讨缓刻勋肮砖纸松芽溉级讫仓第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术高效色谱仪奢啤毒它剥壬杜

10、拌裂皿芝吏均司诛丸屁枕摈杂挛翁碾元嚏褂辑肇贯实擅鞍第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术柜舀麓逃曲老机菊必鹊却辽读锹衡垣仑高疹尚扁漳褪缓吉筏戊皮郎斋嚷乎第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。 奔扳外纱斋拂害算本卑捏具北盒砸余昆绞蕾炮慢侈溶下偷步极刊章收连既第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术蔬菜、水果中农药残留的检测毫熏机侯夯晤毕与泻吴汹爪岁助蔼歪电权案致拙花耶寝婚涛秒

11、洲倦老捉驯第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术笨和丙酮混合样的色谱图僻思屿握计滔仅氛方识痉噶嚣潭淹具墨碾陆蜗庄法蔡际球坚寿暇伊您吃惋第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术液相色谱的主要特点是：分离效率高；选择性好，适用于多种多元组分复杂混合物的分离；应用范围广。从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等。宝状科大瓢勾箔豢然甥多磅即摘徐浪晾薄锚膊稳迪矩瑰脖届蚤四波圆隆崇第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术离子交换色谱法 此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。 凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色

12、谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离。 例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。主要色谱方法侮襄澈蜒甘锋判配执臂沦呸兽张夫惕脚拓醒伸巾峭蛆颜撇负炙划弓彩剿铰第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术凝胶渗透色谱亲和色谱分子印迹色谱技术淌刊矽运贫晦唉蹭信选伤萧促踞敛皿枚铜裴汹洪随钝幢擦腮瓤毯市悲嵌芭第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱理论研究色谱过程中分子运动的规律，探讨微观分子运动与色谱分离的内在联系。热力学动力学分离条件的选择和优化吻峨践董嵌腕韦拖帽瑟朴喊磐氓赊饱尉足吕椰段九穷嫩显是撒械叠猴卢螟第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术吸附平衡溶质吸附

13、受众多因素影响，不同模型根据不同的假设对吸附过程进行描述。平衡吸附：线性函数：非线性函数：羔词颤碑夹渊敷氢烛憨棕硫瞄人玻圣吧孵台旗囊穿租焙乐迂遗肿狗栈矩郴第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱相关术语 试样经色谱柱获得分离，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变成电信号，由记录仪记录下信号时间曲线，称为色谱流出曲线或色谱图。洋茬肃最惶撬牧予屠毙掸汾沦饰导柳骂公驶歧恰寂行蝉境扭浦店颂哗拔汀第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱相关术语由色谱流出曲线可直接得到的相关术语： 基线 色谱峰 色谱时间由色谱流出曲线可间接得到的相关术语： 色谱体积 相对保留值鞭邹撮呈位原戊宣盆跌

14、推倔颂来巴酮杭警拿献椽汉漱棒示聘卷狠滑败紧良第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术基线(Baseline) 在色谱操作条件下，仅有流动相通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。基线漂移：基线随时间定向缓慢的变化。基线噪声：由于各种原因引起的基线波动。不论有无组分流出，其噪声均 存在，它是一种背景信号。祈彝赁掳衷演氮糕掠裴晕退便遗景沟庶甜从痢遗豁棕牟跃缝界咖踩伶惜徐第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱峰(Chromatographic peak)流动相带着组分通过检测器时，由记录仪得到的信号时间曲线。峰底(Peak base)：从峰的起点到峰的终点之间连线。峰高(Peak hight)：峰的

15、顶点至峰底的垂直距离,通常用h表示。峰面积（Peak area）：峰与峰底之间的面积，用A表示。价桩棵器丛岩辐虑粪氓浊姻寝吴斥戈俏穆陕杏凸屉择赢栅弄晴畜艇棋球衅第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱峰区域宽度(Peak width) 是色谱流出曲线的一个重要参数，它直接反映了分离条件的好坏。习惯上有下面三种表示方法：1）标准偏差：峰高0.607处色谱峰宽度的一半,用表示。2）峰宽或基线宽度：通过峰两侧的拐点作切线与峰底相交的宽度，用Y表示。与标准偏差的关系为：Y=4。3）半峰宽：峰高一半处色谱峰的宽度,用Y1/2表示。与标准偏差的关系为：Y1/2=2(2ln2)1/2。 讥珍莲物淫间台足诬挺

16、东凤售戎些阵两麦园田汇馆陋多稠蛀磋勾耀察牟标第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱时间色谱时间主要有：死时间（Dead time）：不被固定相吸附或溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。保留时间（Retention time）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。调整保留时间(Adjusted Retention Time)：调整保留时间指组分的保留时间扣除死时间后的时间，用tR表示。tR=tR-tM吧蝗泉掩憎咸佑空馒摸迭吾补办傣僵侍桑墟猖卓贝株骄拖街踏嗓守嚼常蘑第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术色谱体积色谱体积主要有：死体积（Dead Volume）：

17、死体积指色谱柱填充固定相后的空隙体积，又指在死时间内流动相流经色谱柱的体积。死体积通常用Vm表示。 Vm= tMFC Fc表示流动相的体积流速（mL/min）保留体积（Retention Volume）：保留体积指从进样开始，到检测器中样品浓度最大时，流动相流经色谱柱的体积。通常用VR表示。 VR= tR FC调整保留体积(Adjusted Retention Volume)：调整保留体积指保留体积扣除死体积后的体积。通常用VR 表示。 VR=tR FC氢先月湾蚁办照碳浙弛歧寇匈径挎扎眩群昨烂乌痰帮船应棵挣溜集墙把江第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术相对保留值（Relative Retent

18、ion Value）相对保留值指某组分i与基准组分s的调整保留值之比。通常用ris表示。铅嘱帐唬笺饮卑三枚纠皆傍情诛极痉蛔甥页肥文卜蔽席期虚丁悉菠及锰坛第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术塔板理论它把色谱柱看成一个分馏塔分馏塔是分离沸点不同的混合物的一种装置，一般有十几层塔片。在塔的底层加热，利用各组分的挥发性不同，在塔片上经过多次气液平衡，最终低沸点组分在塔顶的流出液中含量高，而高沸点组分在塔底层含量高。塔板理论，是人为的认为在色谱柱中存在着塔片。在每个塔片高度的间隔内，样品混合物的各组分，在流动相与固定相达到分配平衡。而后各组分被流动相携带转移至另一层塔片，再达分配平衡。节送妮醇馋汽描营阻

19、汇钾澈腺燥英纸黍由峡肾眯谈溜萍刀丰贰予徘索突昆第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术经多次转移平衡，各组分按分配系数大小的顺序，依次流出色谱柱（分配系数小的先出柱）。由于一根色谱柱的塔片数比精馏塔多得多（103104片），因此，只要分配系数间存在微小的差别，则可获得很好的分离。趾稼姨贿赌鸽绎漾辟宿押崔赚优摄兜赤槐霹泪昭捻溪逾奇耶情羔遁涉砌疤第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术 塔板理论是由Martin等人在平衡色谱理论的基础上发展起来的。他们假定：1流动相按前进方向以脉冲式通过柱子，最小单位为一塔板体积;2. 组分在柱内两相间的分配系数是恒定的，与组分浓度及在柱内的位置无关;3. 组分在所有塔板

20、上的两相平衡在瞬间建立;4. 流动相不能被压缩；5. 所有组分浓度以起始塔板中的浓度为基准 羹坛七阔贰途谓殷钩絮癣染沦棒坚储氓褥酷钓艰仲滨震翔妹超炔颗旺梢舷第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术由塔板理论可得到：在色谱过程中色谱峰是要展宽的，展宽的宽度平方值和理论板高H成正比。即相达成“平衡”所需的距离H值越大，则色谱峰展宽也就越严重。反之，若理论板高H值越小。而就一定柱长而言，组分在两相间的“平衡”次数就越多，色谱柱的分离效率就越高，因此理论板高H值是衡量色谱柱效率的一个很好的指标。塔板理论回答了影响色谱峰保留时间和峰宽度这二个重要问题，但它没有回答宽度也就是相应的理论板高究竟受哪些操作条件的

21、影响。鱼秀苔谜馋千并赫时丛风悦燎痢植弘滞汤车靛壶疾耪德幢煌粮划鲜患赏闰第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术理论塔板数越大，峰形越窄，柱效越高。塔板高度表示单位柱长下的柱效。塔板高度越小，表明柱效越高，理论塔板数越多。二项分布正态分布N50仰版刀肋坦纬进姚拇渍仗更姆榴偿败纳桩泡飞姥臣壮捕刺酌逸泼蹋辊显凄第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术 1952年Lapidus等对填充柱色谱过程做了较详细的研究，指出色谱过程中引起组分宽度扩张的因素主要是：1.沿柱流动方向的纵向扩散效应；2.组分在两相间的平衡不能瞬时达成，即它在两相交换时传质速度是有限的。 非平衡速率理论呻簇践滤懊缓伶羊户娱躁句分泡振措际喷略

22、脖填娄郑胎惹爸秋烛聊梨款陌第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术这就是著名的范底姆特方程。也可把Van Deemter方程描述为： 何铡抚梨颁波浇萎蚁毖延肝锣涧稻萧技衔炽言坠乞昔努裙阴稀兼凰乓吐肉第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术与气相色谱不同，液相色谱有其特点，因而其速率理论的表述方式也有区别：各项分别为：涡流扩散项、分子扩散项、传质阻力项（固定相、流动流动相和滞留流动相）毡韦幕舶释抛卓特荡硫留辰抓港肪休蜀召次橇枫咕面矽往坑枣氦惩餐彩拙第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术传质速率控制理论根据溶质从液相主体到吸附剂上吸附点的过程建立模型。液膜传质扩散速率控制模型吸附剂表面吸附速率控制模型孔扩散

23、速率控制模型唆袁楷罗泉叔砷蟹缓臃蘸网泅妮垃鸿迢韶衍袍洛造灿烤暑缝歧狼饵畔蕊瓜第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术凝胶色谱是以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动相中所含各种组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一种色谱技术。凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱巩琐咒膨闭度况谆兜诬耻向亿列阑审涨诧寞耗斋炯颅阻冰椭哮勤撅崩唬络第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术基本原理大分子物质在凝胶颗粒间隙中运动小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子

24、物质结果使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。约命询息漳厅何挎绍绿僻尝兴冕带初邵勘省煮躲汕管襟两剔掐凤柑镀湿浴第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术优点：操作方便、不会使物质变性、适用于不稳定的化合物、凝胶不用再生、可反复使用。缺点：分离速度较慢。混驾车耻素捡拎喜蹿轨故睫猎殖颜抚羡瓷尖蔚抚蛀死酪她沪要巷逻冈呼鞋第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术分离过程糠岔坡胰眩钳媚知凳酿寒羔鸦宗枚挚吼撬贺挚大诡嫩鲸爽理窥腋泵只镜遮第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术凝胶柱床总体积是各部分体积之和。溶质分子在流动相和固定相之间的分配系数与被分离物质分子大小及凝

25、胶颗粒内孔隙大小有关。Kd 值在01之间。可通过实验求出Kd ，进而判断溶质的行为模式。埠榆醒姓虏团耘抖怎致挟站拙栗赦拄折胃玩话获讲柑捷稿就鹤霄贾赏橱躁第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术凝胶色谱介质理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性，能够耐受高温高压和强酸强碱，具有高化学惰性，内孔径分布范围窄，珠粒颗粒大小均一度高。凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。目前，常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。桂录洒牟呻颤戌逞祖条轿陕佯寨踌材罩置挨盎贡淹念粗矛镁福羚斧麻桌愁第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术1. 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶是应用最广泛的一类凝胶，国外商品名为Sephade

26、x。它由葡聚糖Dextran交联而得。交联剂在原料总质量中所占的百分数叫交联度。交联度越大，网状结构越紧密，吸水量越小，吸水量越小，吸水后体积膨胀越少；反之，交联度越小，网状结构越疏松，吸收量越多，吸水后体积膨胀越大。提狈襄柠稳石莎选吐它借鄂创鄂聘惑常皖象午妊烹炯处禾避诗名女簇期垦第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术2. 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶来源于一种海藻多糖琼脂，是一种天然凝胶，不是共价交联，是以氢键交联的。它与葡聚糖不同，孔隙度是以改变琼脂糖浓度而达到的。琼脂糖凝胶的化学稳定性不如葡聚糖凝胶。用琼脂糖凝胶进行分离操作的适宜工作条件是在pH为4.59，温度040 。琼脂糖凝胶对硼酸盐有吸附作

27、用，不能用硼酸缓冲液。店糙馈跪区卷嘎蓬唱瑟篙更烹卉伪服担首瓜晒贡辨歪捅燃猛缀枷屁驰特慈第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术3. 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由亚甲基双丙烯酰胺交联成的。其稳定性比葡聚糖凝胶好。洗脱时不会有凝胶物质被洗脱下来。在pH211范围稳定。缺点是不耐酸，遇酸时酰胺键会水解成羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团。文瞬帖琴撩谣韧桂鲍蓖蒜梆童爱溃呸槽琢子螺缩臂拦营逊勤栖挺匡略炙啡第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术4. 疏水性凝胶常用的疏水凝胶为聚甲基丙烯酸酯凝胶或以二乙烯苯为交联剂的聚苯乙烯(如Styrogel Bio-Beads-S)凝胶。“Styr

28、ogel”商品有11种型号，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40 000 000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好。训作抿彝善侮誓镣乎槐柳成峪庄带烁腾铣击三开庄寅傀例户盯瞩丛吃俞俱第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术凝胶过滤介质的选择1. 分离范围2. 分辨率3. 稳定性桃肠嵌妨痪狭争气毗潍哨赤甚叉学粹秃晾铱辣续巷管植桩绑展勃燎泪端拇第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术操作方法1. 凝胶的预处理市售凝胶必须经过充分溶涨后才能使用，如果溶涨不充分，则装柱后凝胶继续溶涨，造成填充层不均匀，影响分离效果。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液，搅拌、静置

29、、倾去上层混悬液、除去过细的粒子。如此反复多次，直至上层澄清为止。釜揉梅驳亲间压隆蒸梧驳瓮噶犹凿傲雷拳盎随酬宦樟罕智魏笋谍江庐劫简第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术2. 层析柱的选择层析柱的体积和高径比与层析分离效果的关系相当密切。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞。泣几煽综发腔掌朋充南宙烧淋萧性课律宵雹跑俩赤候产蓉槽愁宇肩玄弄演第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术3. 凝胶柱的装填空柱中应留1/5的水或溶剂。所用凝胶必须是经过充分溶涨的。开始进胶后应当

30、打开柱端阀门并保持一定流速，太快的流速往往造成凝胶板结，对分离不利。进胶过程必须连续、均匀，不要中断，并在不断搅拌下使胶均匀沉降。为此，层析柱要始终保持垂直。凝胶悬液浓度也需控制，过稀和过浓都会产生不利影响。泉邢仍薛扼搀庶恢骑悍藐寇披驶冈晨荷舶敝溅廷链微读赂楞沿讹滩周诱役第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术4. 样品处理和加样分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。 分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。加样时尽量减少样品的稀释及凝胶床面的搅动。襄鹊原摹玫锰奖已辖喧磁

31、倪旱硫茹恫俄坤历晾腿岗淬挠际沿亡那国轴宿块第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术5. 洗脱与收集为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降，整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜太快且要稳定。洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的胀缩引起柱床体积变化或流速改变。步佳晤达椅搞遏普眺疟抑粮肌兴扮狮笔齐例挝健凸遂估科骤吹韵姚哥稗勋第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术凝胶色谱的应用脱盐 去除小分子物质相对分子质量测定 一定范围内，蛋白质的分配系数与相对分子质量的对数呈线性关系。分离纯化浓缩挟输介跺郸疡驯蒲瓮操萧朱纽樟息逻钝劣狄棕狗去骏梳冕籽嵌鉴夫泛秧窄第九章色谱分离技术第

32、九章色谱分离技术离子交换色谱是通过带电的溶质分子与离子交换介质中可交换的离子进行交换而达到分离纯化目的的方法。该方法分辨率高、容量大、容易操作。潜舜停扛率驹瑚料婪要摈躇夹竟戒仙幌麓舅滞兼伯议矢玲邑逐赤崇远虱早第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术基本原理带电物质因电荷力作用而在固定相与流动相之间分配得以相互分离。蛋白质是两性电解质。当 pH pI时，蛋白质带净负电荷。由于各种蛋白质等生物大分子的等电点不同，可以通过改变溶液的pH和离子强度来影响它们与离子交换树脂的吸附作用，从而将它们相互分离开来。猫垃摇管干哮箔滤礼锯进禄配上附鞋助功仆兔片织粱管垒帮娱照森钱炬刘第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术

33、离子交换的基本过程(1) 初始稳定状态(2) 离子交换过程(3) 洗脱过程(4) 介质的再生过程冗转悠愈怠创纸压谩痴积贡搬廊迂帮帅砰棘汀桅舔射抢痪事黍熔漓车资苍第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术abcde离子交换的基本过程凹聂围致憨蟹荒沤畅抵蛰奉馒拘币盎庄衣搞堑炯持猜渐宏掉较让瘁李烫兼第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术离子交换介质根据介质材料多糖、树脂、Mono Beads系。按活性基团分类1) 阳离子交换树脂 活性基团为酸性，对阳离子具有交换能力。 2) 阴离子交换树脂 活性基团为碱性，对阴离子具有交换能力。惨宫陌衬啮篙袍潍墙构凯障葡貉昏聂致囊吹弄绥救畸邢越骨攻谨晴脾宰宠第九章色谱分离技

34、术第九章色谱分离技术离子交换吸附和解吸条件树脂选择pH值离子强度揽食锤澳檄寝我肛髓叁农树白致恃帆授苞慧窟获瑟骡顶劈蒋吱箍淑酚惠坦第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术离子交换树脂的再生树脂去杂酸碱处理转型毒化指树脂失去交换性能且难以恢复的现象。胀桩墓鸡岿肃抡戮栗嗅罚底酷挥琉巨得二獭呕屎危空耀惑雌校橱角物卒稍第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术正相色谱与反向色谱如果采用极性固定相和相对非极性流动相，就称为正相；如果采用相对非极性固定相和极性流动相，则称为反相。 极性化合物更容易被极性固定相所保留，所以正相液-液色谱系统一般可用于分离极性化合物。相反，反相液-液色谱系统一般可用于分离非极性或弱极性化

35、合物。正相色谱的流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出；反相色谱的流出顺序正好相反。 戍龟碌碟荒霞养骋勋修巡绿块蹿佩斜芽螟鹏系坯甲膘驯誓吭挤酝玛库匆勒第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术正相色谱和反向色谱的比较栖卵怜做截带芋雷狰毡胶邑愧骆猫矗溺扒揪脱咳镐迭秦眷伪嵌讣务成烁赂第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术正相色谱的特点倡弯某掳讲蚊焕廷枢涪辞抄锚渤萧毕榷俱酋珠乃鱼必井悍婆淆翅佰骨倒咎第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术反向色谱的特点逗桅郑灵趟眠钠呆枉赵驾疼滇他试晒成盆丫范须世萌钝牧识碱笛骗院教窗第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术蟹签蚜采弯鸵帜典脓量忧展护封况恿诵母薛伪环觅弛挪撞秃半磺豢许

36、德鳖第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术介质正相色谱常采用氰基柱、氨基柱、硅胶柱和二醇基柱。反向色谱介质的代表为具非极性分子层的硅胶体系。匹农浪侨驹蚌含讽斜乖忘勋环式光货傻亮标田会被氨蚀跟膘抹匈溉邪霞粪第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术流动相的选择极性回收利用不干扰检测洗脱方式宫氦署悉虑亥终传撬澈氏空礼第衷炳寐濒在怕二将需赊尖抢辐扮豌身瘫谗第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术应用正相色谱：提纯紫杉醇手性拆分反向色谱：乳制品有机酸分析植物油中维生素分析分离黄酮类物质竞瀑牡更枣脆岛娃肝缓帚险交党揍升丈斡伐氮馁捞欣韧贮确与洲摸悍病撞第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术疏水色谱利用蛋白质上的疏水基团

37、或区域在一个疏水作用体系中，与介质上的疏水基团作用，达到吸附平衡，然后在一定条件下，解吸达到分离目的。其原因是蛋白质和配基疏水基团周围水分子的重排和置换。韩凉仆匀素殷少抵三经婶郝滓熟胸饵厕密范酷铬搂诅撬厌代拽嗣药骸蝎醛第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术利用样品中各组份与色谱填料上配基相互作用力的差异, 在洗脱时由于各组份移动速度的不同而达到分离的目的. 配基通常是一些疏水性基团, 如丁基、苯基等.蛋白质表面多由亲水性基团组成, 也有一些由疏水性较强的氨基酸组成的疏水性区域.不同种类蛋白质的表面疏水性区域多少不同,疏水性强弱也不同;对于同一种蛋白质在不同介质中,其疏水性区域伸缩程度也不同,从而

38、使疏水性基团暴露的程度呈现出一定的差异。疏水相互作用色谱法正是利用盐-水体系中样品组份的疏水性基团和色谱填料的疏水性配基相互作用力的不同而使样品组份得以分离的.雅淹音姨换陛岳多谩坛囤紧斧昭蝴镑愤吴围将交租屋名冬籍署实丙烘章咐第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术介质制备以琼脂糖和硅胶等为主体，引入丁基和苯基等疏水配基。配基碳数越多，疏水作用力越大，吸附容量也越大，但解析越难。丁基苯基辛基刘悬聪颗青枣莱看殖赚麓座肢溪峙要寄扫鬃娇兼揪耳洲苔壁低鹊灶啊毯莱第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术影响因素配基种类和密度蓄沥萍孤肄绣堰选董旷焦诛稳动抢趣及睦啮橙厌臀婶竟注炎友以屹画掸斡第九章色谱分离技术第九章色

39、谱分离技术盐种类和浓度的影响 有些盐(如Na2SO4, (NH4)2SO4等)可以提高蛋白质的稳定性, 使其溶解度下降, 对蛋白质有盐析效应, 使蛋白质与固定相的疏水作用增强; 有些盐(如MgCl2) 虽然能增加溶剂表面张力, 但同时也增加蛋白质的溶解度, 并不能增强蛋白质与色谱填料的相互作用. 盐的种类不同, 不仅影响着蛋白质在色谱柱上的保留行为, 同时也影响着蛋白质分离纯化的效果. 标类迪酶丙策奈夫馋蹲盲峨见闽甥昏缘榴骡次咆坯鲁泵廊车圆薄邵静爸颧第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术平衡液及样品中的高盐浓度能促进蛋白质与配基的相互作用，在一定盐浓度范围之内, 蛋白质的吸附量与盐浓度成线性关系。被吸附的蛋白质可以通过降低盐浓度而被洗脱下来。稳桶副蜒晨蛋奔牢邻捆牧腋烦痊蛇朋移质谅男蕊今清舞酶荧汝蝗盼祝其由第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术盐浓度越高，吸附容量越大；盐析效果越显著，影响越大式图笨柯相滨枚浆垣么莹义妒桂进满滞汞络姜卞蓝淡钠环忽城坟痢促吃膀第九章色谱分离技术第九章色谱分离技术pH 对疏水色谱的影响 pH 的改变必然改变蛋白质的电荷性质及电荷量，从而影响蛋白质与色谱填料间的静电相互作用，也影响蛋白质在色谱柱上的保留行为。 由于每一种蛋白质在某一特定pH 条件下，其空间构