细胞生物学试验-课件

1、课件说明本课件是为本院的细胞生物学教学制作的，适用于生物科学、生物技术专业的本科生实验教学。本课件结合实验条件与学生的实际情况，内容包括一些常用的细胞生物学基本实验，如特殊显微镜的使用、显微摄影技术、细胞化学技术、细胞组分的分级分离、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、细胞生理活动等。课件除对实验原理、过程作简明的文字阐述外，还包含相当的图表，使学生直观地了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法。本课件的使用有助于培养学生动手实践、观察分析和解决问题的能力。细胞生物学实验常用实验动物的了解和解剖器械的使用 一、常用实验动物 细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其

2、特点及基本处置做一简单的介绍。 蟾蜍 蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。1雌雄鉴别 通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l3趾基部有被称为婚垫的黑疣。 2捉拿及处死方法： 常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。

3、小白鼠 小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。 1捉拿方法： 将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。 2处死方法： 处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。小鼠的脱臼处死法 3给药方法： 小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注

4、射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针12mm后，再以45角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.10.2ml10克体重。 二、常用手术器械及操作方法： 1解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。 2解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开

5、，或分离皮肤和肌肉等。 3大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。 4眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。 5眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。 6钝头镊子：用于提取脏器、组织等。 7有钩镊子：用于提取皮肤切口等。 细胞生物学实验绘图方法与要求(一) 生物绘图的要求具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向

6、右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。(二) 生物绘图的方法 点点衬阴法:将图形画出后，用铅笔点出圆点，以表示明暗和深浅，给予立体感。在暗处点要密，明处要疏，但要求点要均匀，点点要从明处点起，一行行交互着点，物体上的斑纹描出再点点衬阴，点点衬阴法要求不能用涂抹阴影的方法以代替点点，此点初学者要尤为注意。 轮廓图（左）和细胞图（右）实验一 普通光学显微镜的结构及其使用 目的要求1、掌握普通光学显微镜的主要构造及其性能;2、掌握低、高倍镜的正规使用方法，反复练习，观察时保持

7、两眼同时睁开和两手并用。实验用品光学显微镜、各种动植物玻片标本。 实验内容和方法一、光学显微镜的主要构造 主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分 (一) 机械部分 1.镜座 2.镜柱 3.镜臂 4.镜筒 5.调节器 6.物镜转换器(旋转盘) 7.载物台(二)照明部分 1集光器 :(1)集光镜 (2)虹彩光圈 2反光镜(三)光学部分 1目镜 常备有23个目镜，上面刻有5x、10 x、15等符号以示其放大倍数，可选择使用，一般常用的目镜倍数为10 x。 2物镜 主要性能指标放大倍数和镜口率(如100.25、400.65和1001.25)，镜筒长度和所要求的盖玻片厚度(如1600.17)。 二

8、、显微镜的使用方法 显微镜在使用前，应先检查一下它的各个部件是否完整和正常，并进行必要的清洁工作，然后将显微镜放置在自己左肩前方的实验台上，离桌子边缘36cm为宜，以便观察。 (一)低倍镜的使用方法 1对光 2放置玻片标本 3调节焦距 (二)高倍镜的使用方法1.一定要先在低倍镜下找到要观察的标本物像后，再把需要放大的部分移至视野正中，并把物像调节到最清晰的程度。 2转动物镜转换器(三)油镜的使用方法 1.在高倍镜下找到所要观察的标本移至视野中心。2.把集光器上升到最高位置，光阑开到最大。3.移开高倍镜，在要观察的部位的盖玻片上滴加一滴香柏油作为介质。4稍稍上升镜筒或下降载物台，使油镜对准通光孔

9、，慢慢转动粗调螺旋，使油镜与油滴接触，再小心地使它贴近盖玻片表面。5用眼观察目镜，微微上升或下降载物台，直到出现清晰的物像。6油镜使用完毕，先用拭镜纸蘸少许二甲苯将镜头上的大部分油去掉，再用干拭镜纸擦拭。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。四、操作练习思考题 一、在调焦操作时，为什么低倍镜要先调到距标本片表面6mm处，油镜一定要贴近标本片表面？如果把标本片放反了，将会出现什么问题？为什么？二、在低倍镜调节焦距时。当视野中出现了能随标本片移动而移动的颗粒或斑纹。是否只要调节推进器将标本对准物镜中央，就一定能观察到标本的物像?为什么? 三、你如何分析判断视野中所见到的污物点是在目镜上?

10、四、使用显微镜观察标本，为什么定要从低倍镜到高倍镜再到油镜的顺序进行? 五、在转动细调螺旋时，如已达极限转不动时，你应如何解决? 实验二、几种特殊光学显微镜的工作原理及其使用目的要求 了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和倒置显微镜的工作原理、构造和使用方法。 实验用品 暗视野显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、荧光显微镜（透射式和落射式）、黑纸片、剪刀、圆规、无荧光镜油、培养的活细胞、丫啶橙染色玻片标本、活细胞临时装片（盐藻）。 实验内容和方法一、暗视野显微镜(一) 原理和结构特点 原理:利用光学上的丁达尔现象设计的。 结构特点:中央遮光板或暗视野聚光器，从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察

11、的标本上，照明光线在聚光器顶透镜（或盖片）的上表面发生全反射，因而背景是暗的。标本被斜射光照射发生反射或散射，在黑暗的背景下呈现明亮的像。只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 （三）使用方法 1装暗视野聚光器。 2选用强的光源，一般用显微镜灯照明。 3在聚光器和标本片之间要加一滴香柏油。4升降集光器，将集光镜的焦点对准被检物体，应首先进行中心调节，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。 5以下操作方法同普通显微镜。 （四）观察二、相差显微镜 (一)原理和结构特点 原理：相差显微镜能够改

12、变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相差变成振幅差(明暗差)，可用以观察活细胞或未染色标本。 结构特点：用环状光阑代替可变光阑，用带相板的物镜(通常标有Ph的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。(二)使用方法 1相差装置的调换安装 将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，换上相差物镜。 2调焦 3合铀调整 (三)观察 观察活细胞，可清楚地分辨细胞的形态，细胞核、核仁以及胞质中存在的颗粒状结构。用途：观察活细胞和未经染色的玻片标本三、荧光显微镜 (一)原理和结构特点 原理：利用一个高发光效率的点光源，经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光4

13、20nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后，再通过物镜和目镜的放大进行观察。按光路分两种：1透射式荧光显微镜 2落射式荧光显微镜 （二）使用方法1打开灯源，预热几分钟。 2透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片双色束分离器阻断滤片的插块。 3用低倍镜观察，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 4放置标本片，调焦后即可观察。 (三)观察 用蓝紫光滤光片，可见经0.01的丫啶橙荧光染料染色的细胞，细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。 荧光

14、显微镜照片（微管呈绿色、DNA蓝色） 四、倒置显微镜 光学原理与普通光学显微镜原理基本相同，主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方，物镜装在标本的下方，因此可以用来观察生长在培养皿底部的细胞状态。它与相差装置配合，可以用来观察培养的活细胞。 作业 一、比较四种特殊的光学显微镜。 二、为什么说倒置相按显微镜是观察培养活细胞的最有效显微镜? 三、荧光显微镜的两种滤光片各起什么作用? 四、描述在特殊光镜观察到的盐藻形态。 实验三、显微摄影技术目的要求：掌握显微摄影原理、装置及其操作技术，能独立完成全过程实验用品: 复式光学显微镜、摄影装置、各色滤光镜、胶片、显影罐、黑白放大机、暗室袋、暗盒、定时

15、器、标本玻片、显影及定影液实验内容和方法一、显微摄影装置 专用摄影目镜，再装上一个无镜头相机，测光系统可提供感光量参考值；自动控制感光装置似“傻瓜”相机，以图像亮度自动设定感光时间，并据此开启快门曝光。 二、胶片的选择 高分辨力、大反差、色饱和度高而颗粒细，感光灵敏度低。胶片的照相性能： 感光度；反差系数；宽容度；解像力；标准倒易率失效补偿值 三、显微摄影的一般步骤（一）拍摄前准备工作1、显微镜的光路合轴：聚光器的调中 ，光源调中 2、选用合适的物镜和目镜；3、合理调节孔径光阑的开度；4、加用滤色镜 （二）装入胶片：同普通相机（三）取景和聚焦（1）屈光度调节： （2）取景： （3）聚焦： （四

16、）曝光： 显微摄影拍摄的曲细精管横切面（精细胞的不同发育阶段） 思考题一、显微摄影为什么特别强调提高影像的反差，如何提高？二、取景聚焦时，为什么要进行屈光度调节？三、什么是倒易率失效？显微摄影时如何对待它？四、你认为要得到一张较好的显微摄影照片，应注意那些方面的问题，主要关键是什么？ 实验四、DNA的原位显示Feulgen染色法目的要求 1、掌握Feulgen反应的基本原理 2、掌握Feulgen反应操作全过程。 3、熟悉细胞化学技术实验用品 光学显微镜、恒温水浴锅、染色缸、小烧杯、滴管、载玻片、Schiff试剂、1N的HCL溶液、3%的亚硫酸氢钠溶液，4.5%的醋酸、洋葱根尖 实验原理 DN

17、A经弱酸（1N的HCL）水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，使脱氧核糖的一端形成游离的醛基，这些醛基在原位与Schiff试剂（无色品红亚硫酸溶液）反应，形成紫红色的化合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色阳性反应。紫红色的产生是因为反应产物的分子内含有醌基，醌基是一个发色团，所以具有颜色。对照组预先用热三氯醋酸或DNA酶处理，抽提去细胞中的DNA而得到阴性反应，从而证明了Feulgen反应的专一性。 实验内容和方法（一）Feulgen反应的一般步骤： 1、取一小段洋葱根尖于小烧杯中，用1N盐酸60水浴中水解8min。2、去盐酸，用蒸馏水漂洗片刻。3、Schiff液染色30min。4、用新

18、配制的亚硫酸氢钠溶液洗3次，每次约5min，直至出现红色5、用自来水洗5min。6、滴一滴4.5%醋酸于载玻片，将根尖放于载玻片的醋酸中，加盖玻片，轻压。7、镜检：细胞内DNA的部位呈紫红色。 思考题一、简述Feulgen反应的原理。二、欲得到一张好的Feulgen反应制片，制片过程中应注意些什么？ 实验五、细胞内过氧化物酶的显示目的要求 1、掌握原位显示细胞内某种酶的原理。 2、掌握原位显示细胞内某种酶操作过程。实验用品光学显微镜、解剖盘、染色缸、微量注射器、解剖器械、0.5%CuSO4、 0.2%联苯胺、1%番红、3%H2O2溶液、小白鼠、马铃薯 实验原理 细胞内存在的过氧化物酶能把许多胺

19、类氧化成有色化合物，联苯胺可被细胞内的过氧化物酶氧化成蓝色或棕色产物（蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可自然转变为棕色的联苯胺腙），因而显示出细胞内过氧化物酶的分布。另外细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢（H2O2），过氧化物酶使其分解成水，对机体起保护作用。通过植物块茎与过氧化氢相遇后所发生的反应间接证实酶的存在。实验内容和方法 （一）小白鼠骨髓细胞过氧化物酶的显示1、取材：处死小白鼠取股骨，剪断两头，用微量注射器吹出骨髓细胞于载玻片上，涂片，晾干。2、固定：将涂片放入0.5%硫酸铜染缸中固定30S1min。3、氧化：取出涂片直接转入0.2%联苯胺染缸中氧化36min。4、冲洗：蒸

20、馏水或自来水冲洗。5、染色：滴1、2滴1%番红溶液于涂片上，染色1min。6、冲洗：蒸馏水或自来水冲洗，晾干。7、镜检：可见骨髓细胞内有被染成蓝色或棕色的颗粒，就是过氧化物酶的部位。（二）植物细胞内过氧化物酶的间接显示1、徒手切片：取马铃薯以徒手切片法切取小薄片于载玻片上。2、滴加3%的过氧化氢溶液于载玻片上，可见组织周围出现大量的气泡，提示植物细胞中存在过氧化物酶。 思考题一、过氧化物酶显示方法的实验原理是什么？ 实验六、细胞融合目的要求 1、了解细胞融合的原理。2、掌握细胞融合的实验方法实验用品 血球计数板、水浴锅、离心机、光学显微镜、载玻片、Alsever溶液、50%PEG溶液、酶液（消

21、化细胞壁）、13%CPW洗液、20蔗糖溶液、GNK液、生理盐水、Janus greenB染液、鸡血红细胞实验原理 在某些诱导物（如仙台病毒、聚乙二醇等）的诱导下，使亲本细胞膜发生一定的变化，能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。 PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，一些正极化集团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca2等阳离子。Ca2可在一些负极化基才和PEG之间形成桥，因而促

22、进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。灭活的病毒介导细胞融合实验内容和方法一、植物原生质体的融合1、原生质体的分离将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（去表皮面接触酶液），在25黑暗条件下，酶解12小时。过滤除去未完全消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。加入34ml13%CPW洗液，相同条件下离心2分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20蔗糖溶液上（5ml离心

23、管装3ml20蔗糖溶液），在1000rpm条件下离心510分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体悬浮在20蔗糖溶液与13CPW溶液之间，破碎的细胞残渣沉于管底。 用200l的移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加入4ml13CPW洗液，1000rpm离心2分钟，弃上清，用血球计数板调整原生质体密度为105106之间。2、原生质体融合 将12滴原生质体混和物（密度为105106之间）滴入小培养皿（或载玻片上），静置810钟，相对方向加入2滴40的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1ml和2ml含13甘

24、露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、第三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能洗干，否则原生质体破碎死亡。最后用培养基洗12次即可进行培养。3、观察 二、动物细胞的融合1、鸡红细胞悬液（1：4的悬液）的制备。2、洗涤：1200r /min离心5min，去上清，再以上述条件离心洗涤两次。3、将沉淀加入2-3 ml GKN液，混匀。4、计数，稀释至每毫升1.5106个。5、悬液1 ml放入37（39左右更佳）预热。同时将50%PEG液预热。6、待温度恒定后，在1ml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml50%PEG液，边加边摇匀，放入水浴锅中。7、细胞融合20-30min后，加入GKN液至8 ml

25、，静止于水浴锅中20min左右。8、取出离心管，800r/min离心3min，使细胞完全沉降。去上清，加GKN液，再离心一次。9、去上清，加少量GKN液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入Janus green染液，用牙签搅匀，3 min后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。 思考题一、细胞融合率受那些因素影响？二、在进行细胞融合时要注意那些问题？三、简述植物原生质体融合培养研究的实践意义。 实验七 细胞凝集反应目的要求 1、掌握细胞凝集反应的原理。2、掌握细胞凝集的实验方法实验用品 光学显微镜、离心机、载玻片、生理盐水、PBS液、Alsever液、土豆块茎、韭菜叶子、兔血红细胞实验原理 细胞膜是双层

26、脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又能与糖分子结合为细胞表面的分枝状糖外被。目前认为：细胞间的联系，细胞的生长和分化，免疫反应和肿瘤发生都和细胞表面的分枝状糖分子有关。 凝集素是一类含糖并能与糖专一结合的蛋白质，被认为其与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂调控有关。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。 大多数凝集素存在于储藏器官内，作为一种氮源；对某些植物而言，受到危害时凝集素作为一种防御蛋白发挥作用。凝集素与糖的结合活性以及专一性决定其功能。实验内容和方法 一、2%兔血红细胞制备： 二、土豆块茎：1、提取

27、凝集素：称取土豆去皮块茎4g，加少许磷酸缓冲液研磨成匀浆，最终加到30ml磷酸缓冲液，浸泡2h，浸出的粗提液含有可溶性土豆凝集素。2、测定血凝活性：3、用磷酸缓冲液作为对照。三、韭菜叶片：1、取3-5 g韭菜叶片，按1：1（W/V）加入生理盐水，用捣碎机或研磨成匀浆，过滤，滤液在5000r/min下离心20min，收集沉淀，用磷酸缓冲液5ml溶解。2、加硫酸胺（约1.8g）至60%饱和度沉淀，5000r/min下离心20min，沉淀用1ml磷酸缓冲液溶解。3、测定血凝活性：4、用磷酸缓冲液作为对照。 思考题一、那些因素影响细胞凝集反应？实验八 细胞器的分离与观察目的要求1、掌握细胞器分离的原理

28、2、掌握离心分离细胞器的一般操作程序实验用品 普通离心机、冷冻高速离心机、8ml离心管、 eppendorf管、匀浆器、光学显微镜、解剖工具、纱布、载玻片、冰块、生理盐水、0.25mol/L蔗糖溶液、0.34mol/L蔗糖溶液、固定液（甲醇-冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、 Janus green B、小鼠实验原理 利用各种物理方法如研磨、超声振荡和低渗等将组织制成匀浆，细胞中的各种亚组分即可从细胞中释放出来。由于细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同，在同一离心场内的沉降速度也不相同。不同大小的生物颗粒可以利用不同的离心机分离 。通过组织匀浆、分级分离和分析三步完成。差速离心法：由低速

29、到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮于上清液中的较小颗粒分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离，必须反复悬浮和离心加以纯化。密度梯度离心法：用密度具有梯度的介质来代替离心管中的密度均一的介质，使介质分为不同层次，浓度低的在上层，浓度高的在底层。细胞匀浆加在最上层，随后离心。这样，不同大小、形状、密度的颗粒，就会以不同的速度向下移动，集中到不同区域，可以分别收集。实验内容和方法1、低速分离细胞核（1） 将小鼠杀死，取出肝脏，剪成数小块，用预冷的生理盐水反复洗涤除去血污，用滤纸吸干表面的水分。 （2）称取肝组织1g，取8ml预冷的匀浆介质，先加入少量于小烧

30、杯中，尽量剪碎肝组织，再将剩余的预冷匀浆介质加入其中。（3）匀浆，用8层纱布（先用少量匀浆介质润湿）过滤匀浆介质至离心管中，离心管内匀浆液为8ml。（4）普通离心机里以2500r/min的速度离心15分钟，缓缓吸取上清夜，移入eppendorf管中，放在有冰块的器皿中，等分离线粒体时用。同时制一张上清夜涂片A，做好记号，自然干燥。（5）用8ml离心介质悬浮沉淀物，用吸管混匀，以2500r/min的速度离心15分钟，吸弃上清夜，沉淀物加入0.5ml离心介质，用吸管吹打成悬液，制备1张涂片B，做好标记，自然干燥。2、高速离心分离提取线粒体（1）将装有上清夜的eppendorf管取出平衡，在冷冻高速

31、离心机上以15000r/min离心20分钟，缓缓吸去上清夜，留取沉淀物。如沉淀的表面有1层浅色的疏松层时，则应连同上清夜一起小心吸去。（2）沉淀再加入预冷离心介质悬浮，用tip头吹打后再以15000r/min离心20分钟。（3）将上清夜吸入另一eppendorf管中，留存沉淀物中加0.1ml的匀浆介质混匀成悬液（可用牙签）。eppendorf管同时置于冰浴中，待制片时鉴定用。3、分离物鉴定（1）细胞核：将涂片A、B浸入甲醇-冰醋酸液中固定15分钟，充分吹干，滴姬母萨染液（原液稀释10-20倍）染色10分钟。自来水冲洗，吹干，镜检。（2）线粒体：取步骤3中，上清液和沉淀物悬液分别做涂片C和D，马

32、上各滴1滴1%詹纳氏绿B染液染色20分钟，盖上盖玻片镜检观察。思考题一、叙述动物细胞线粒体的提取过程及其注意事项。二、如何鉴定上述方法提取的最终产物是线粒体？ 实验九 线粒体及液泡系的超活染色与观察目的要求1、掌握细胞器超活染色的原理2、掌握细胞器超活染色的技术方法3、熟悉线粒体及高尔基体的形态、大小实验用品 光学显微镜、解剖工具、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、1/5000Janus green B染液、Ringer溶液、1/3000的中性红染液、小鼠、洋葱、蟾蜍实验原理 超活染色或称体外活体染色是指使已离体的或刚被杀死的生物体内的活细胞保持生活状态，再用活体染料进行染色的一种方法。

33、詹纳斯绿B(Janus green B)可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B被还原成无色的化合物。当与中性红结合使用，进行双重超活染色，能使线料体显示得更清楚。 中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核和细胞质完全不染色，这可能和液泡系中的某些蛋白质有关。一、洋葱鳞片表皮细胞线粒体的活体染色1、撕下一小块洋葱鳞片的内表面，放在载玻片上的染料中，并使其展开，染1015 min。2、用吸管吸去染液，加一滴Ringer溶液

34、。3、加盖玻片。4、先用低倍镜进行观察，找到细胞后，即可转入高倍镜继续观察，可见洋葱表皮细胞被一大气泡占据，此时，要注意细胞核位于细胞的近中部的一侧。在它的周围有致密的原生质体，在原生质中有被染成蓝绿色的小颗粒，此即线粒体。二、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞的液泡系中性红染色与观察 1、将蟾蜍处死，剪取胸骨剑突最薄的部分一小块，放入载玻片上的1/3000的中性红染液滴中，染色5-10min。2、用吸管吸去染液，滴加Ringer液，盖上盖玻片进行观察。3、在高倍镜下，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核及核仁清楚易见，在细胞核的上方细胞质中，有许多被染成玫瑰红色大小不一的泡状体，这一特定区域叫“高尔基区”，即液泡

35、系。思考题一、何谓细胞活体染色？二、叙述詹纳斯绿染液对线粒体进行超活染色的原理。三、为何用软骨细胞来进行液泡系的超活染色。 实验十 细胞骨架的显示和观察目的要求1、掌握细胞骨架显示的原理。2、熟悉细胞骨架显示的方法。实验用品光学显微镜、恒温水浴锅、小烧杯、载玻片、PBS液、1%的TritonX-100、0.2%的考马斯亮蓝R250、M缓冲液、3%的戊二醛、洋葱实验原理 细胞骨架（cytoskeleton）是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成和形态结构的不同分为微管（microtubule，MT）、微丝（microfilament，MF）、中间纤维（intermediatefilament

36、，IF）。它们对细胞的形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质的运输等起重要作用。观察和研究细胞骨架可用光镜、电镜、间接免疫荧光技术、细胞化学技术等方法。对光镜下细胞骨架的形态学观察多用1%的TritonX-100（聚乙二醇辛基苯醚）处理细胞，使95%以上的可溶性蛋白质以及全部脂质被抽提，再以蛋白质染料考马斯亮蓝R250染色，使细胞内细胞骨架得以清晰显现。实验内容和方法1、取材：撕取小块洋葱鳞茎内皮，浸于6mmol/LPBS中，使其下沉，处理5-10min。2、抽提：加2ml1%的TritonX-100，于37水浴处理30min。 3、冲洗：用M缓冲液轻轻洗3次，每次5min。4、固定：

37、3%戊二醛固定20min。5、冲洗：用6mmol/LPBS液洗3次，每次5min。6、染色：用0.2%考马斯亮蓝R250，染色10min。7、制片：用蒸馏水洗2-3次，在载玻片上铺展开，加盖玻片。8、观察：细胞内应力纤维思考题一、细胞骨架显示的原理是什么？二、说明实验中所用TritonX-100、考马斯亮蓝R250、戊二醛的作用。 实验十一 联会复合体的染色与观察目的要求1、掌握光镜显示联会复合体的技术。2、观察光镜下联会复合体的形态。实验用品光学显微镜、离心机、培养皿、解剖器械、酒精灯、吸管、量筒、擦镜纸、小烧杯、载玻片、0.7%的柠檬酸钠、3%中性福尔马林、50%硝酸银、明胶显影液、固定液

38、（甲醇：冰醋酸=3：1）、雄性小鼠（性成熟）实验原理 联会复合体（synaptonemal complex，简称S.C）最早由Mose（1956）在研究精蝲蛄精母细胞减数分裂前期的超微结构时发现，1977年他又证明使用光学显微镜可以检测联会复合体。其后发展了许多适用于明视野显微镜检查用的S.C染色法。依靠光学显微镜显示S.C技术，不仅对于S.C功能和结构的研究有用，而且在临床细胞遗传学中对染色体异常、遗传性疾病的病因和病理研究，以及环境诱变剂的检测等不失为一种新的有效研究手段。 S.C是减数分裂前期同源染色体配对形成的非永久性核内特殊结构，典型的S.C由三股平行的线状结构组成，即两条平行侧线和

39、一条纤细的中央轴组成。一般开始于偶线期，成熟于粗线期，消失于双线期。它与减数分裂三个重要环节同源染色体联会、交换以及分离有着密切的关系。大量工作表明，S.C在真核生物的减数分裂过程中是普遍存在的。 实验内容和方法1、处死小鼠，取出睾丸，放入盛有2ml0.7%柠檬酸钠培养皿中。2、剪开白膜，用解剖针和小弯镊挟出曲细精管并剪碎，用吸管轻轻吹打，使曲细精管内容物释放出。使细胞悬液总体积为1ml。3、移至刻度离心管中，加0.7%柠檬酸钠至6ml，室温下低渗1h。4、低渗终止前10min，加3%中性福尔马林0.3ml，混匀。5、常规离心（1000r/min）10min，弃上清。6、沉淀中加2-3 ml固

40、定液（甲醇：冰醋酸=3：1）固定10min。7、滴冰片，在空气中晾干。8、银染：（1）在培养皿底部放一张用少量蒸馏水润湿的滤纸，上放2根小玻棒（或竹杆），置于水浴内保温（80）（此过程可不放在水浴中，直接将标本放在热至80的电热板上亦可）。（2）玻片标本细胞面朝上平放其上，加4滴50%硝酸银和2滴明胶显影液，复以盖玻片（或擦镜纸），直到玻片呈金褐色为止，一般为3-4 min。（3）移除盖玻片，并用蒸馏水快速漂洗，晾干。9、镜检思考题一、研究联会复合体的生物学意义？联会复合体实验十二 小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察目的要求1、熟悉并理解细胞吞噬活动的生理过程2、掌握诱导产生小鼠腹腔巨噬细胞的方法

41、实验用品 光学显微镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器械、1鸡红细胞液、6淀粉肉汤(含台盼蓝)、生理盐水、肝素钠溶液、小白鼠试剂的配制： (1)6淀粉肉汤：称取牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠O.5g和台盼蓝(trypan blue)0.3g分别加入到100ml蒸馏水中溶解，再加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，置4保存，使用时温浴溶解。实验原理 高等动物体内存在着具有防疫功能的吞噬细胞系统，它由粒细胞和单核细胞等白细胞构成，是机体免疫系统的重要组成部分。在白细胞中，以单核细胞和粒细胞的吞噬活动较强，故称为吞噬细胞。当单核细胞在骨髓中形成后会进入血液，通过毛细血管进入肝、脾、淋巴结及

42、结缔组织中进一步发育为巨噬细胞。巨噬细胞是体内的一种重要的免疫细胞，具有非特异性吞噬功能，当机体受到细菌等病原体及其它异物侵入时，巨噬细胞将向病原体或异物游走，当接触异物时，伸出伪足将其包围并进行内吞作用，将病原体或异物吞入细胞，形成吞噬泡，进而初级溶酶体与吞噬泡发生融合，将异物消化分解掉。本实验将观察到小鼠巨噬细胞对进入其体内的鸡血红细胞进行吞噬的情况。单核巨噬细胞实验内容和方法(一)标本制备1、在实验前两天，每天每只小鼠腹腔注射6淀粉肉汤(含4的台盼蓝)lml。2、实验时经上述处理的小鼠，腹腔注射1的鸡红细胞悬液lml。3、20分钟后再向腹腔注射O5ml生理盐水，轻揉小鼠腹部。4、3分钟后

43、用颈椎脱臼法处死小鼠。5、吸取腹腔液。6、每人取一干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，标本便制备好了。(二)观察 将制备好的巨噬细胞标本置于显微镜下观察。调节光线使视野中的亮度降低，在低倍镜下找到标本后换高倍镜观察。先分辨巨噬细胞和鸡红细胞。巨噬细胞体积较大，呈圆形或不规则形，表面具有多个突起(伪足)，胞质中含有数量不等、大小不一的蓝色颗粒，它们是细胞吞噬含台盼蓝的淀粉肉汤后形成的吞噬体；鸡红细胞呈椭圆形，淡黄色，具椭圆形的细胞核。在视野中仔细寻找巨噬细胞吞噬鸡红细胞的不同阶段。有的鸡红细胞紧贴在巨噬细胞表面；有的红细胞已部分被吞入；有的巨噬细胞已吞入1个或多个红细胞，形成了吞噬泡。还可见有

44、的吞噬泡体积已缩小并呈圆形，这说明该吞噬泡已与溶酶体发生融合，泡内的物质正在消化分解。综合性实验外周血培养及核型分析 细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。 Moorhead和Levan等(1960)建立的人体外周血淋巴细胞培养技术，以及Rothrels等(1958)建立的气干法制片技术，成了研究人与哺乳类染色体的最主要技术。一、实验目的和要求1、 掌握无菌操作的原理和方法；2、 掌握外周血培养的原理和方法；3、 掌握显微摄影和图象分析的原理和方法；4、 掌握外周血淋巴细胞染色体制备的技

45、术;5、 综合运用已掌握的知识基础和已具备的 实验能力，提高科学研究的综合素质。 二、实验原理 细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。 外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G。期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重

46、新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形状而利于辨认。染色体标本制备过程中有两个重要环节， 原理如下：(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细固定质量及标本质量。(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构

47、固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。三、实验用品(1)器材：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、超净工作台、无菌培养瓶、10ml离心管、显微摄影装置。（2）试剂：RPMI 1640或Eagles MEM培养液、小牛血清(FCS)、PHA、秋水仙素、O075M KCl、甲醇、冰醋酸；肝素、Giemsa、pH68的PBS。（3）材料：动物外周血四、实验方法（实验操作要点）(1)采血：

48、用肝素润湿注射针筒(o2m1)后，常规取静脉血约12ml，转动针筒混匀肝素。（2)接种(在超净工作台中无菌操作)：在每个培养瓶中(含20血清的1640培养液5ml，pH72)，加入全血O25O30ml(7号针头1315滴)、PHA 5mg，盖紧胶塞，轻轻摇匀后。（3)培养：将培养瓶放在37恒温培养箱内培养72 h。终止培养前24 h，加入O01秋水仙素溶液(100gm1)12滴(7号针头)，使终浓度为02gml培养液。轻轻摇匀后，放回培养箱继续培养24h。(4)收获：将培养后的血细胞收集在离心管中，平衡后1 000rmin离心8 min，弃去上清。（5)低渗：向离心管中加入37O075molL KCI溶液至8ml，用吸管轻轻吹打混匀细胞，置于37水浴箱温育15 min。（6)预固定：向离心管中滴加新配制的甲醇一冰醋酸固定液12 ml，用吸管轻轻吹打混匀后1000rmin离心8min，弃去上清。(7)固定：加入新配制的固定液至8 ml，室温静置30 min。1 000 rmin离心8min，弃去上清。可再重复固定1次。 （8)制片：根据沉淀细胞的多少，加入适量新鲜固定液(O5lml)，轻轻吹打制成细胞悬液。用滴管吸取少量细胞悬液，滴至冰冷的载玻片上，立即甩口。吹散，酒精灯火焰过一下，冷