浙江大学生物化学实验甲SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量

1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量1.1、原理电泳法分离、检测蛋白质混合样品，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带静电荷的多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。蛋白质分子在外加电场下的泳动行为可用下列函数式表示： EQV = 6rv：分子泳动速度 Q ：分子所带净电荷E：电场强度 r ：分子半径：介质粘度1SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基磺酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量的大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在

2、。2SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变原有的空间构象，特别是在强还原剂，如巯基乙醇存在下，由于蛋白质分子内的二硫键被还原，从而保证了蛋白质分子与SDS能充分结合，形成带负电荷的蛋白质- SDS复合物。3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量这种复合物由于结合了大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。SDS与蛋白质结合后，还会引起蛋白质分子发生构象的改变，使蛋白质复合物在水溶液中的形状近似于雪茄烟

3、形的长椭圆棒。不同蛋白质-SDS复合物的短轴长度都一样，约为1.8nm，长轴则随蛋白质分子量成正比变化。4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量这样的蛋白质- SDS复合物在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度，也就是蛋白质分子量的函数。当蛋白质的分子量之间时，蛋白质分子的电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下列方程式：5SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量lgMw = -b mR + KMw：蛋白质的分子量 mR：相对迁移率b： 斜率 K ：截距当条件一定时，b，K 均为常数，即此时lgMw 与mR的关系为线性关系，

4、 如以lgMw对mR作图，应 得到一条直线，如右图：lgMwmR待测mR待测lgMw6SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量如将已知分子量的几种标准蛋白质的相对迁移率对分子量作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得该蛋白质的分子量。电泳用的支持介质为凝胶，常用的有聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)和琼脂糖凝胶（agarose）。本试验用聚丙烯酰胺凝胶。7SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（单体，Acr）和甲叉双丙烯酰胺（双体，Bis）在催化剂（TEMED）和引发剂（AP或VitB2）作用下聚合而成的三维网

5、状结构的凝胶。单体和双体单独存在或混合在一起都是相对稳定的，若有自由基存在则可引发二者的聚合。8SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量自由基引发的方式有化学法和光化学法两种，前者的引发剂是过硫酸胺（AP），后者的引发剂是核黄素（VitB2）。两种方法的催化剂都是四甲基乙二胺（TEMED）。在一定浓度范围内，改变聚合体系中Acr和Bis的比例，可得到不同网眼大小的凝胶，由于凝胶的三维网状结构，对在凝胶中泳动的不同分子量的质点有着选择和阻碍，因此使凝胶本身又具有分子筛效应。9SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续和不连续系统两种，不连续电泳系统是采用两种不同

6、的缓冲液配制两种不同浓度的凝胶，它可使样品在两层胶的界面处浓缩，从而大达提高了电泳的分辨率，使之特别适用于稀样品的分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳法的特点：简便、快速、重复性好，只需几微克的样品即可进行测定。当分子量范围时，所测得的结果与用其它方法测得的结果相比，误差一般不超过10%。10SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量1.2、材料与试剂1、试验材料新鲜植物叶片（大蒜、菠菜、韭菜）2、试验试剂11SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量标准蛋白质 名称 分子量（104D）-半乳糖苷酶 11.60牛血清白蛋白 6.62鸡卵清蛋白 4.50 乳酸脱氢酶 3.50核

7、酸内切酶抑制剂 2.50-乳球蛋白 1.84鸡蛋清溶菌酶 1.44 其它试剂及使用时的注意事项参见P67。12SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量1.3、操作方法1、凝胶的制备试剂名称 12%分离胶 4%浓缩胶30.8%胶母液 3 ml 0.35mlTris-HCl (pH 8.9) 0.9 mlTris-HCl (pH 6.7) 0.3 ml10%SDS 75 ul 25ulTEMED（原液） 4 ul 5 ulH2O 3.5 ml 2.3 ml10%过硫酸铵（AP） 60 ul 25 ul13SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量2、样品的提取及处理、样品的提取取新鲜叶片，冲

8、洗干净，吸干表面水分，去掉叶脉，称取去脉叶片0.5g，加入0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液2ml，加石英砂少许研磨成匀浆，10000r/min离心10min，上清备用。、样品的处理取30ul待测样品的上清于离心管中，加入30ul浓样品溶解液，混匀，置于100水浴中保温35min，取出冷却备用。14SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量若待测样品浓度太稀应事先浓缩；若样品盐浓度太高则需先行透析，再进行上述处理。其它操作步骤及注意事项解说详见P68。1.4、实验结果及处理15用直尺分别量出染料的迁移距离和各样品区带的迁移距离，如图所示： 按下列公式计算相对迁移率mR：0加样浓缩胶染料迁移距离样品