实验四 高效液相色谱法测定水体中的苯酚及α

1、高效液相色谱法测定水体中的苯酚和萘酚一、实验目的1、了解色谱法的分离原理，初步学会使用高效液相色谱仪；2、利用高效液相色谱仪分离测定水体中的苯酚及a-荼酚。二、实验原理1、色谱法的分离原理溶于流动相中的各待测组分经过色谱柱固定相时，由于各组分与固定相发生 作用（吸附、分配、离子吸收、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞 留时间不同，从而先后从固定相中流出，达到分离的目的，又称色层法、层析法。2、高效液相色谱仪使用原理高效液相色谱仪由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等 几部分组成四个系统即高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样

2、器进入流动相， 被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不 同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱 内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以 图谱形式打印出来。正是根据物质的定性与定量关系，不同的物质顺序离开色谱柱，通过 检测器得到不同的峰信号，最后通过分析比对这些信号来判断待测物所含 有的物质。3、苯酚及a-荼酚的分离原理及标准溶液准备对于一些组分比较简单的已知范围的混合物，或无已知物的情况下，可以利 用保留值定性。保留值的大小取决于分配系数之比，即与

3、组分的性质、固定液的 性质及柱温有关，与固定液的用量、柱长、流速及填充情况无关。在一定操作条 件下，用对照品配成不同浓度的对照液，定量进样，用峰面积或峰高对对照品的 量（或浓度）做校正曲线，求回归方程，然后在相同条件下分析试样，计算含量， 这种方法称为校正曲线法。通常截距近似为零，若截距较大，说明存在一定的系 统误差。本实验，苯酚的波长为270nm，a-荼酚的波长为295nm。使得两种物质 的吸收峰达最大值，最终选定在254nm条件下。分别配置单样和混合液浓度为 100mg/L、80mg/L、60mg/L、40 mg/L、20mg/L 标准溶液，分别进样，记录保留 时间和出峰面积，用于定性分析

4、。绘制标准曲线，用于定量分析，计算出样品浓 度。三、实验仪器和药品高效液相色谱仪；流动相过滤器；超声波清洗器；分析天平；100 mL容量瓶3个、250 mL容量瓶、200 mL量筒、滴管、100应-1000应 移液枪、20由-200应移液枪；苯酚、a-萘酚、乙腈、蒸馏水。四、实验步骤1、开机前准备工作查资料，确定流动相的比例，一般选用甲醇、水、乙腈按比例配制之后根据 需要选择不同的滤膜，对流动相进行抽滤除杂质；再进行超声脱气泡1020min； 配制样品和标准溶液，必要时也用0.45pm滤膜过滤。2、开机（1）开启计算机，运行Bootp Serve程序。（2）依次开启仪器各模块电源。（3） 待各

5、模块自检完成后，设定参数。菜单栏单击control-monitor instrument，单击Pump图标，出现参数设定菜单，设定Flow 1.0 mL/min，单击 Pump off变为Pump on；单击Light图标后，单击Light off变为Light on；关闭 菜单栏。3、在线检测（1）在工作界面，选择通道，填写实验信息，在方法菜单栏上点击采样控 制，设置采样时间、文件保存路径、保存方式、文件名。（2）在方法菜单栏点击积分，选择积分参量、积分方法、样品重量、积分 最小面积，时间参数等相关参数后点击“采用”按钮。（3）在方法菜单栏点击谱图显示，设置时间显示范围、电压表示范围、谱 图

6、显示颜色、数据显示内容，点击“采用”按钮。（4）在方法菜单栏点击仪器信息，输入相关仪器参数。（5）在通道菜单栏点击数据采集，观察流动相基线是否平稳待，基线平稳， 在检测器通过“zero”键调零。标样谱图：用进样针抽取相应量标品，把手动进样器扳钮按逆时针方向旋全 “load”处，将进样针插入进样孔，注入标液，注完将进样器扳钮按顺时针方向 旋至“inject”处，同时点击外带按钮或数据采集菜单栏“采集数据”按钮。数 据采集完毕，自动积分，文件存于相应地址。样品谱图：在方法菜单栏点击组分表，在对话框点击谱图按钮，调入标样谱 图，通过鼠标拖动圈住对应峰，设定相关参数，点击采用按钮，用进样针抽取相 应量

7、样品，进样方式同标样。点击采集按钮，采集时间结束，文件存于设定地址。4、分析色谱图在住界面点击Reprogress进入界面后双击右侧图标后，打开文件，点击所保 存的文件名既看到图谱。点击|（analysist）显示保留时间和峰面积，记录数据 做标准曲线。计算标准线性方程；待测样品进样后，记录相同保留时间下的物质 峰面积，代入方程计算含量。5、关机试验结束后用纯甲醇将色谱柱冲洗干净，一般用纯甲醇冲洗13h，待记录 仪上无杂质峰后关机，关闭稳压电源。五、实验结果浓度（mg/L）苯酚保留时间（min）苯酚峰面积 （mv）a萘酚保留时 间（min）a萘酚峰面积（mv）55.8701088517.817

8、11832105.8852071217.84322597205.8383952617.81042753406.3938595319.47284744606.39513234219.53111818806.37720167019.1282112661006.26321893319.343249168样品绘制苯酚、a萘酚标准曲线。六、注意事项流动相的制备要与装置相适应，必须经过过滤、脱气并恢复到室温后使 用，以防气泡的产生；样品溶液进样前必须用0.45 Mm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损；转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵 内压力剧增，甚至超过泵的最大压力，再转到进样位时，过高的压力将使柱头损 坏；为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。 通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗；输液泵的压力必需稳定，才能取得良好的分析结果。变动的幅度大致在 0.5MPa以内范围为正常；在一段时间内不进行分析时，建议清洗柱子，并从装置