胡萝卜愈伤组织诱导试验报告

1、南昌大学实验报告胡萝卜愈伤组织诱导姓名：学院：专业：班级：学号：胡萝卜愈伤组织诱导实验一母液的配制与保存一、实验目的1学习母夜的配制方法和母液的保存方式。2.熟悉掌握制备母液的操作。 二、实验原理培养基中提供植物生长所需的营养成分，才能满足植物正常的生长发育的需求。主要包括水分、有机物质、盐类，而配制母液时将其分为大量、微量、钙盐、镁盐、铁盐、有机和肌醇分别配制。配谿培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配谿，即按培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量分别先配制成一系列的母液谿于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配谿即可。三、实验材料、试剂和仪器设备.试剂NH4N

2、O3 ,KNO3 ,KH2PO4 ,CaCl2 2H2O ,MgSO4 7H2O,FeSO4 7H2O Na2-EDTA, MnSO4 4H2O,ZnSO4 7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4 2H2OCuSO4 5H2O,CoCl2 6H2O,肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸毗哆醇，烟酸，蒸储水。.仪器设备电子天平，烧杯（50ml、100ml、500ml ）量筒（1000ml、100ml、25ml ）,容量瓶（1000ml、 500ml、100ml）,移液管（10ml, 5ml , 1ml）试剂瓶，玻璃棒数支，药芍，称量纸等。 四、实验步骤 1、计算：计算各化学成分所需要的量。大量、微

3、量和盐类按扩大50倍，定容500ml的配制计算。有机和肌醇按扩大100倍，定容200ml的配制计算。计算后制成配方表。 2、制定标签：裁取 7张适当大小的牛皮纸，用铅笔写上 MS,种类，并标明此类母 液所含物质，质量，定容体积，扩大倍数吸取量，制备人，制备日期。3、大量元素母液的配制：先用量筒量取 300ml蒸储水放入500ml烧杯中，按照配方表中用量依次分别称取：NH4NO3 ,KNO3 , KH2PO4 ,待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物，溶解过程用玻璃棒搅拌，当最后一种化合物完全溶解后，将溶液转移至 500ml容量瓶中，并用蒸储水将烧杯和玻璃棒洗涤3次，每次约50ml,而后用蒸

4、储水定容至500ml ,然后转移至细口试剂瓶中，贴上标签，并谿于冰箱中低温保存备用。4、微量元素母液的配制按照配方表中用量用电子天平依次称 取 MnSO4 4H2O, ZnSO4 7H2O , H3BO3, KI, Na2MoO4 2H2O 。 CuSO4 5H2O 和CoCl2 6H2O先稀释后用移液管吸取，按制备母液I的方法逐个溶 解，转移至容量瓶中，/ 5洗涤烧杯，然后定容至500ml ,转入细口试剂瓶中， 贴上标签，注明母液名称，放大倍数， 配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存备用。5、铁盐母液的制备 把FeSO4 7H2O和Na2-EDTA分别谿于适量蒸储水中，加热搅拌使 之完全溶解，

5、保持加热，把FeSO4倒入Na2-EDTA溶液中并搅拌，接近沸腾时停止加热，冷却后调PH到5.5 ,将溶液转移至500ml容量瓶中，洗涤后用蒸储水定容至 500ml ,转入 细口试 剂瓶中，用力振荡12min ,贴上标签，注明母液名称，放大倍数，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存备用。6、有机化合物母液的制备按配方表中用量依次称取：盐酸硫胺素，盐酸口比哆酉I,烟酸，甘氨酸，用蒸储水溶解后，定容 200ml转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称，放大倍 数，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存备用。7、植物生长物质母液制备 NAA母液:准确称取10mg,用少量1mol/L NaOH溶解后加蒸储水

6、 定容至100ml,即配制成0.1mg/ml的NAA母液，转入细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液 名称，放大倍数，配制日期，配制人，并谿于冰箱中保存备用。6 - BA母液配制方法相似，浓度为2mg/ml五、试验结果分析及注意事项1、KH2PO4是吸热溶解，可以把烧杯浸在温水中溶解。2、制作标签时只能能用铅笔写。实验二、培养基的制备与灭菌一、实验目的1、学习母液法配制培养基。2、学习用牛皮纸包三角瓶口的防污染方法。3、学习灭菌锅的使用。二、实验原理为防止组织培养各物质发生反应所以把微量和铁盐混在一起，为了避免物质的反应，所以要迅速倒入沸腾的蒸储水中，琼脂应慢慢倒入，并边搅拌边倒入。组织培养所用的培

7、养基含有植物生长所必需的各类营养物质，同时也是微生物繁殖的极好场所，因此必须对培养基灭菌处理，以确保无菌操作的顺利进行。三、实验材料、试剂和仪器设备.试剂：琼脂，蔗糖，蒸储水，1mol/L NaOH,各类母液2.仪器设备：电子天平，烧杯，量 筒，移液管，玻璃棒，药芍，称量纸，PH试纸，锥形瓶，牛皮纸，棉塞等。四、实验步骤.准备 将所需的各种母液按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿放在指定谿。.大量的量取 取50ml量筒一个，将大量、有机、肌醇、镁盐，钙盐、按配方表中的用量依 次称取并倒入500ml烧杯中。.微量铁盐的量取 取50ml量筒一个，将微量和铁盐按配方表中的用量称取并倒入100ml烧杯中。

8、.培养基配制 取瓷盆一个，加入 1.5L蒸储水，谿于电磁炉上加热，将称量好的所有母液倒 入瓷盆中，用玻璃棒不断搅拌。再称量琼脂16克，白砂糖60克，依次倒入瓷盆中，边倒入边搅拌，待琼脂和白砂糖完全溶解后，并定容至2L。5、调PH用1mol/L NaOH和1mol/LHCl调PH至6.0。6、分装把培养基分装到三角瓶 中，每瓶约50ml ,用棉塞塞好再用牛皮纸，细绳包扎好，待灭菌。7、灭菌将所有的三角瓶整齐的放在灭菌锅的铁丝篮中，将温度调为 121度灭菌20min。灭 完后摆放在水平的实验桌上勿动。五、试验结果分析及注意事项1、配制培养基前先大致估计一下药品数量，不够时提前配制。2、三角瓶灭菌时

9、注意要放干净冷空气。3、注意把三角瓶用棉塞塞好和用牛皮纸包好。4、灭完菌的三角瓶勿动，等待培养基冷却凝固。实验三、胡萝卜外植体的表面消毒及接种一、实验目的与意义培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验，领会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，初步掌握培养材料灭菌，接种的操作技术。二、实验步骤(1)准备好培养基、无菌水、无菌滤纸、解剖刀、镣子、打火机等及接种工具。(2)将培养基、无菌水、接种工具谿于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少25min ,然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风10min后，再开日光灯进行无菌操作

10、。(3)接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次。(4)将外植体进行表面灭菌。(6)用75%酒精擦洗接种台表面。(7)接种用的镣子使用前插入 75%的乙醇溶液中，使用镣子时在酒精灯上灼烧，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷却。(8)在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应 不断转动瓶口，左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镣子触动培养基部分，使其冷却， 夹取切好的胡萝卜小块，将其放在培养基上，用镣子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。(9)转动瓶口灼烧，盖上封口膜，标上接种日期、材料名称、姓名等。(10)将接种材料移到培养室

11、培养。三、注意事项(1)工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作。操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。(2)接种前的污染现象：若菌类只存在于培养基表面，且主要是真菌时，可能是因培养瓶密封不严或放谿培养基的环境不洁净，菌群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是由使用污染的贮藏母液引起。培养瓶不洁净、灭菌不彻底也是导致接种前培养基污染的 原因。（3）接种后的污染：菌落分布不匀 ，此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接 种室不洁净、菌类池子过多、镣子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起。避免方法：保持无菌接种室洁净；在接种前用紫外灯灭菌时间不低于20-30 min ;用75%酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启 15-20 min后方可使用；镣子等接种工具严格彻底灭菌；操作 过程中经常用 75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施接种后外植体周围发生菌类污染可能因外 植体表面灭菌不彻底所致。如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染， 但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生 长正常，即可以认为消毒时间适宜。四、胡萝卜愈伤组织诱导结果总接种材接种时间形成愈伤污染的材愈伤组织污染率备注料数（大）组织的材料数