大蒜5[1]7(共12页)

1、- PAGE 15 -大蒜(d sun)汁对纳豆发酵中芽孢形成的影响(yngxing)李金凤 （湛江师范学院生命科学与技术(jsh)学院，湛江 524048）摘要：为了提高纳豆芽孢杆菌的芽孢数量，通过添加抑菌物质大蒜汁，探究大蒜汁添加浓度、添加量对芽孢形成量的影响。结果表明，大蒜汁的最佳添加浓度和添加量为1:3，5%，后熟过程中，大蒜汁延缓了芽孢形成的时间，但提高了芽孢的产量。关键词：纳豆芽孢杆菌 大蒜汁 芽孢数量Effects of Garlic Extract on Spore Production in Fermentation of NattoLi Jinfeng(Life Scien

2、ce and Technology School,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048)Abstract: In order to improve the spore quantity of Bacillus natto, through added antibacterial thing garlic extract, effects of the concentration and addition of garlic extract on the spore production were researched. The results

3、 showed that the best concentration and addition of garlic extract were 1:3 and 5%，garlic extract not only can have prolonged the time of spore production ,but also improved the spore production in the post-maturation.Key words: Bacillus natto ; garlic extract ; spore quantity纳豆（natto）是盛行于日本的一种传统发酵大

4、豆食品，由纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto）在一定的温度和湿度条件下，通过发酵蒸煮大豆制备而成，它被认为是日本人长寿的“秘方”。 新鲜成熟的纳豆色泽金黄，口感酥软，表面覆有一层粘性物质，挑起时有长长的拉丝样物质，配以适宜佐料，深受日本人喜欢，被作为佐餐必不可少的风味食品。纳豆除独特风味外，还具有预防高血压、抗肿瘤、抗氧化和延缓衰老等多种功效，是一种很好的保健食品。另外有试验表明纳豆芽胞杆菌能增强以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长，对肠杆菌和肠球菌等条件致病菌的生长有一定的抑制作用，这都有助于宿主调整肠道正常菌群，维持肠道微生态环境的平衡。纳豆菌能在条件不利的

5、情况下能形成芽孢，食用后能抵制胃酸的作用，在肠道中保持较好的活力。因此，纳豆芽孢杆菌的芽孢是纳豆产品的一项重要指标。纳豆的发酵(f jio)是一个碱性发酵过程，在纳豆发酵(f jio)过程中，由于纳豆杆菌(gnjn)产生的酶可将蛋白质分解为多肽,氨基酸和氨等。故纳豆有一股特殊的味道，未必为我国人民接受,因而需加以一定的改进。韩国在这方面已作了许多工作，如加入大蒜、胡椒等调味品，改善了纳豆的口味,但对纳豆所含的功能性物质影响不大1。大蒜、生姜、洋葱是我国饮食上传统的调味品，能刺激味蕾，增强食欲。同时，它们也是被证明含有抑菌活性物质的植物2。本文通过比较这三种抑菌物质对纳豆杆菌的抑制能力,从而选取

6、抑制能力较强的一种添加，进行发酵。添加抑菌物质使纳豆菌在发酵过程中处于不利的环境，从而促进芽孢的形成，通过对添加抑菌物质优化，研究芽孢的动态变化，从而保证纳豆产品中纳豆菌的芽孢数处于一个较高的水平，并且可以改善纳豆的风味。1 材料与方法1.1 材料1.1 .1 菌种纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto），实验室保存1.1.2 原料 黄豆 市售优质黄豆，颗粒饱满、完整、无虫眼；大蒜、生姜、洋葱 市售优质大蒜、生姜、洋葱1.1.3 培养基种子培养基：蛋白胨1，葡萄糖1，磷酸氢二钠0.2，磷酸二氢钠0.1平板计数培养基：胰蛋白胨0.5，酵母浸膏0.2，葡萄糖0.1，琼脂2牛肉(ni ru)膏蛋

7、白胨琼脂培养基：牛肉(ni ru)膏0.5，蛋白(dnbi)胨1，氯化钠0.5，琼脂2 pH7.0 7.4。1.1.4 主要试剂蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米淀粉、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、琼脂、氯化钠、胰蛋白胨、pH6.86标准缓冲溶液、pH4.00标准缓冲溶液、pH9.18标准缓冲溶液1.1.5 主要仪器HHD型电热恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司），立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司），水浴恒温振荡器（富华仪器有限公司）、超净工作台（上海博迅实业有限公司），分析天平，722型可见分光光度计，LXJ-IIB型低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂），GZX-9140MBE数显鼓

8、风干燥箱，pH值测试仪(上海雷磁仪器厂)，SK-1快速混匀器，SPX-250B-Z型生化培养箱（上海博迅实业有限公司） 实验方法1.2.1 大蒜汁、生姜汁、洋葱汁的制备 优质生姜洗去泥沙,大蒜籽剥去外面的膜，将洋葱去皮、洗净,进行切块,分别于灭菌的研钵中研磨至糊状，再于离心机中6000转/分钟，离心20分钟，取上清液作为100%的大蒜汁、生姜汁、洋葱汁，倒入已准备好的无菌三角瓶中,塞紧,置于4冰箱保存备用。1.2.3 菌体的培养1.2.3.1 菌种的活化 从保存的菌种中挑取一环溶于2mL的无菌水中，用无菌移液管取0.2mL涂布于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，37培养24h。1.2.3.2 种子液制

9、备 取活化菌种一环接入装有100mL种子培养基的200mL三角瓶中，37、150r/min、摇瓶培养18h。1.2.4 纳豆制作的基本工艺流程及简要说明 精选的大豆称重浸泡冲洗装入大试管中蒸煮大豆接种发酵放入冰箱后熟成熟纳豆 。 浸泡(jnpo) ：大豆与水的比例为 1：15，浸泡(jnpo)时间1224h 蒸煮 ：在高温(gown)灭菌锅 中 121灭菌，20min。 发酵 ： 37发酵后熟 ：5冰箱保存1.2.5 芽孢的测定方法 活菌总数计数采用周佳庆介绍的方法3 ;芽孢平板计数是在85水浴加热15min后,采用平板菌落计数法检测芽孢的生成量4。1.2.6 pH的测定方法 将发酵成熟的纳豆

10、转移到离心管中捣碎，先加20mL的双 蒸水到离心管中，混合均匀后4200转/分钟，离心10分钟，将上清液转移到25mL的容量瓶中，定容至刻度，用酸度计测定。2 实验设计2.1各种抑菌物质抑菌效果的比较方法：用滤纸片法5 取半径7mm的灭菌滤纸片分别放入原汁液中浸泡2min，并将0.1mL纳豆芽孢杆菌菌悬液涂布于固体培养基表面制成含菌平板，在无菌条件下用镊子取浸泡过的滤纸片贴在含菌平板培养基上，置37培养24h，测定抑菌圈直径，每个实验重复2次。并继续培养，观察抑菌时间。2.2 抑菌时间的计算方法 从出现抑菌环开始计时，到在抑菌环中重新长出第一个菌落为止，为抑菌时间2.3 大蒜汁浓度与抑菌能力的

11、关系、以及大蒜汁最低抑菌浓度（MIC）的确定将大蒜汁配成一系列的不同浓度，大蒜汁和无菌水按11、12、13、14、15、16、17、18、19的比例分别稀释,然后同样采用抑菌圈法，直到没有明显的抑菌圈为止。2.4 纳豆发酵过程中纳豆杆菌(gnjn)的生长曲线取15支小试管(shgun)，分别称取1g豆，蒸豆，进行发酵，每2小时取一支发酵管，加入(jir)20mL无菌水稀释（菌数在108109个/mL,且OD值成正相应关系）6，并用混匀器使之混匀，取上层清液测定，以接种后但未进行发酵的豆用同样的方法稀释为空白对照，用分光光度计测定660nm下的OD值，并绘制曲线。2.5大蒜汁对纳豆杆菌芽孢形成的

12、影响72.5.1 不同浓度的大蒜汁对纳豆杆菌芽孢形成的影响选取三个大蒜汁浓度，1：1（抑菌效果较强）、1：3、最小抑菌浓度，按照最有利于芽孢生长选择添加量添加不同浓度的大蒜汁。发酵28h，取出后立即在85条件下水浴加热15 min，杀死营养细胞，然后进行梯度稀释，用平板菌落计数法计数，测定芽孢的形成。2.5.2 不同添加量对芽孢形成的影响 选取一个添加量的梯度1%、5%、10%分别加入大蒜汁。在豆中按接种量2%加入纳豆杆菌悬液进行发酵，当纳豆发酵中纳豆杆菌处于对数生长期时，按照不同添加量加入大蒜汁，37继续发酵到28小时，取出后立即在85条件下水浴加热10 min，杀死营养细胞,然后进行梯度稀

13、释，用平板菌落计数法计数，测定芽孢的形成。2.6 后熟过程中纳豆芽孢杆菌的芽孢的动态变化2.6.1 不添加大蒜汁发酵，后熟过程中纳豆芽孢杆菌的芽孢的动态变化取15支大试管，称取1g豆，用蒸馏水浸泡24h，在高温灭菌锅中121 ，蒸豆20min，以2%添加量加入纳豆杆菌，37发酵28h，转移，后熟。每四小时取一支管进行梯度稀释涂布，用平板菌落计数法计数,测定芽孢的形成。2.6.2 添加大蒜汁后熟过程中纳豆芽孢杆菌的芽孢动态变化 取15支大试管，按照纳豆发酵流程进行发酵，当纳豆发酵中纳豆杆菌处于对数生长期时，添加大蒜汁。发酵到特定时间，进行后熟。用平板计数法测定芽孢的形成情况。3 结果(ji gu

14、)与分析3.1抑菌物质对纳豆杆菌(gnjn)的抑制效果(xiogu)通过滤纸片法，测得抑制圈大小见表1。表1 抑菌物质对纳豆芽孢杆菌抑制效果的试验结果生姜汁大蒜汁洋葱汁抑菌圈的直径（cm）1.84.41.52.14.31.6平均（cm）1.954.351.55根据表2中生姜、大蒜、洋葱抑菌圈平均数的比较，表明各抑菌物质原汁的抑菌效果为大蒜汁生姜汁洋葱汁。生姜汁的抑菌圈平均大小为1.95cm，大蒜汁的为4.35cm，洋葱汁的为1.55cm。由此可知大蒜汁对纳豆枯草芽孢杆菌的抑制效果最好。大蒜中起到抑菌作用的功能物质主要是大蒜素，它杀菌的能力几乎是青霉素的100倍，另外，大蒜还含有大蒜辣素，科学研

15、究证实：大蒜辣素有很强的抗菌作用；洋葱中的主要作用物质也是大蒜素，但洋葱中的大蒜素的含量很少，因而，洋葱汁具有柔和的抑菌作用；生姜中的作用物质是姜辣素，具有明显的抑菌作用。3.2各抑菌物质对纳豆芽孢杆菌的抑制时间通过观察至抑菌圈内重新长出第一个菌落，确定抑菌的时间。观察记录的结果为：生姜汁和洋葱汁的分别在1天内重新长出菌落，大蒜汁重新长出菌落的时间是2天。可见，大蒜汁对纳豆杆菌的抑制时间比较长。3.3大蒜汁的最低抑菌浓度（MIC）大蒜汁对纳豆芽孢杆菌的抑制作用较强，通过稀释大蒜汁确定最低抑菌浓度。由图1可以看出，当大蒜汁稀释浓度到达1：7时，抑制(yzh)圈的平均大小为1.4cm，说明抑菌作用

16、为0。因此，可以得到大蒜汁的最低抑菌浓度为1：6。另外，从图中可以得知，随着大蒜(d sun)汁的稀释，抑制圈的大小不断减小，说明大蒜汁的抑菌作用与浓度大小成正比。图1 大蒜汁的浓度与抑菌能力的关系1.41.41.651.7522.252.83.200.511.522.533.51:81:71:61:51:41:31:21:1抑菌圈大小（cm）（注：小圆滤纸(lzh)片的直径为1.4cm，所以抑制圈直径为1.4cm时，抑菌作用实际上为0）3.4纳豆发酵过程中纳豆杆菌生长曲线的测定纳豆发酵过程中纳豆杆菌的生长曲线如图3所示。由图可以看出，纳豆杆菌在016h处于延滞期，在16h24h处于生长对数期

17、，24h后进入稳定期。处于对数期的细菌代谢活性最强，生长速度最大，且对环境变化敏感。在对数期加入抑菌物质，使得生长旺盛的纳豆芽孢杆菌由于环境的变化，转化为芽孢，以达到较高的芽孢数。因此，最适合的添加时间为1624h。图2 纳豆发酵过程中纳豆杆菌生长的动态变化00.20.40.60.811.21.41.62h6h10h14h18h22h26h30h光密度OD6603.5大蒜(d sun)汁对纳豆芽孢杆菌的芽孢形成(xngchng)的影响(yngxing)3.5.1大蒜汁添加浓度对纳豆杆菌芽孢形成的影响 从图1中可以知道在1：1、1：3、1：6三个浓度中，芽孢的形成呈现出先上升后下降的趋势，大蒜汁

18、在浓度为1：3时，芽孢数最高，即浓度1：3有利于芽孢的形成。显然，添加的大蒜汁浓度过高和过低都不利于芽孢的形成。可能是由于大蒜汁浓度过高，导致产生了杀菌作用，使纳豆芽孢杆菌的数量下降，从而使芽孢的形成较少；而当大蒜汁浓度过低时，抑菌效果不大，恶劣环境条件不显著，不能促进芽孢的形成。图3 不同浓度的大蒜汁对芽孢形成的影响0246810121416181：11：31：6芽孢总数（109个）3.5.2大蒜汁添加量对纳豆芽孢杆菌芽孢形成的影响 实验结果表明，随着添加量的增加(zngji)，芽孢形成呈现出先上升后下降(xijing)的趋势。添加(tin ji)量为1%时，芽孢数最小，添加量为5%，芽孢数

19、最高。大蒜汁为偏酸性液体，添加量越大，那么发酵的pH值就越低。有实验证明8，pH值77.5时，菌体生长最好，pH值6.57.0时，最适宜芽孢的形成。另外，添加一定浓度大蒜汁的同时也添加了部分水，发酵时水的含量影响氧的供应。纳豆芽孢杆菌是好氧菌,溶氧是菌体生长和芽孢形成的重要因素，通气量大有利于菌体生长,提高芽孢形成率11。当大蒜汁添加量较低时，对发酵液pH值的影响不大（纳豆发酵为碱性发酵，发酵液pH7.0），因而不利于芽孢的形成；当添加量较高时，添加的水份也越多，影响了氧的供应，从而影响芽孢的形成。图4 蒜汁不同添加量对芽孢形成的影响00.511.522.531%5%10%芽孢总数（109个）

20、3.6后熟过程中纳豆芽孢杆菌的芽孢的动态变化由图5可知，芽孢在后熟过程中都是不断增加，后熟一段时间后到达一个较为稳定的水平。当纳豆发酵结束后，转移至冰箱内低温后熟时，纳豆杆菌几乎停止生长，营养体大量转化为芽孢，从而使芽孢快速增长；后熟一段时间后，营养体部分死亡，芽孢也趋于稳定。由图5可得知，不添加大蒜汁的情况下，在后熟416h之间，芽孢不断增加，16h后芽孢数量趋于稳定；当添加大蒜汁时，后熟432h之间，芽孢在不断增加，32h后趋于稳定。添加大蒜汁后芽孢增长的时间比未添加大蒜汁的慢，可能原因是大蒜汁延缓了芽孢的形成过程9；但当芽孢数处于稳定状态时，添加大蒜汁的芽孢数明显比未添加大蒜汁的芽孢数高

21、得多，说明添加大蒜汁可达到增大芽孢形成的效果。另外，从下图中可知添加大蒜汁后，纳豆的pH值明显都是在8.0以下，而未添加大蒜汁时，纳豆pH值比较高，几乎都高于8.0。这是因为纳豆发酵是一个碱性发酵的过程，在纳豆发酵过程中，纳豆杆菌产生的蛋白酶可将蛋白质分解为多肽，氨基酸和氨等，可溶性氨的增多，使pH上升。添加大蒜汁后，抑制了纳豆杆菌的生长，从而使纳豆的pH较低。由于产生氨，使纳豆具有独特的氨臭味，不为我们中国人所接受，而质量好的纳豆应尽量减少这种氨味。表明添加大蒜汁不仅可以提高芽孢的形成量，还可以改善纳豆的风味，更有利开拓纳豆的中国市场。4 讨论(toln)芽孢是产芽孢细菌在生长(shngzh

22、ng)过程中形成的一种抗逆休眠体，并非细菌生活史不可缺少的部分，它的形成受营养物质和环境因素的影响(yngxing)。大蒜具有高效的抑菌活性。在纳豆发酵过程中添加大蒜汁，抑制纳豆芽孢杆菌的生长，使纳豆菌处于恶劣环境，促进了芽孢的形成。本文通过筛选对纳豆芽孢杆菌抑菌作用最强的抑菌物质，确定添加的抑菌物质，确定该物质的最低作用浓度及作用时间。研究大蒜汁添加量、添加浓度对纳豆发酵过程中芽孢形成量的影响，以及后熟过程中芽孢的动态变化。实验结果表明，生姜、大蒜、洋葱三种抑菌物质中，大蒜的抑菌作用最强，且抑菌时间最长。生长对数期中细菌对环境变化敏感，生长能力强，此期间添加抑菌物质，改变生长环境，促使芽孢的

23、形成。由纳豆发酵过程中纳豆杆菌生长曲线图可知发酵16h24h到达生长对数期。添加大蒜汁的浓度为1:3和添加量为5%时，芽孢产量最高，这与不同浓度的大蒜汁具有不同抑菌能力以及添加进的水分有关。在纳豆后熟过程中，添加了大蒜汁后，延缓了芽孢形成的时间，但提高了芽孢的产量。添加大蒜汁可以达到提高芽孢产量的目标；另外，添加大蒜汁还有利于改善纳豆风味。大蒜汁的抑菌时间是有限的，且纳豆在冰箱内低温后熟过程中，纳豆杆菌还在进行低温的熟成发酵，分解蛋白质，时氨味增加，所以纳豆后熟的时间不宜过长，应尽快食用。致谢(zh xi)：本文是在孙鹏老师的关怀和悉心(xxn)指导下完成的，周仙娇老师、蔺红萍(hn pn)老

24、师和刘淑茵、朱晓蕾同学在实验的过程中也给予了我很大的帮助和支持，在此谨向他们表示衷心的感谢！参考文献1 Kim,B.N.& Lee,S.Y.Han guk Yongyang Siklyyong HakhoehiJ, 1995, 24 (2): 2282332 余世望,范青生,肖小年,等.60种食药两用重要抗菌防腐作用研究J.天然产物研究与开发,2000,11(6):1-4.3 周德庆. 微生物实验手册M.上海科学技术出版社,1983.3031;81834 杜连祥. 工业微生物实验技术M. 天津:天津科学技术出版社,1992.1045 Seher Kumcuoglu，Sebnem Tavman，

25、et a1Thermal conductivity Measurement of a traditional fermented dough in the frozen stateJJournal of Food Engineering，2007，78：107910826 ABRIOUEL H,MAQUEDA M,GALVEZ A,etal.Inhibition of bacterial growth, enterotoxin production,and spore outgrowth in strains of Bacillus cereus by bacteriocin AS-48J.Applied and Environme