TNF结合肽和TNFR封闭肽对TNF

1、TNF结合肽和TNFR关闭肽对TNF尹丙姣,喻明霞,王晶,姜晓丹,李卓娅【关键词】TNFBilgialharateristisandeffetfTNFbindingpeptideandTNFRblkingpeptideinvitrKeyrdsTNF;TNFbindingpeptide(TBP);TNFRblkingpeptide(TRBP)摘要目的:检测TNF结合肽TBP和TNFR关闭肽TRBP的生物学特性及成效。要领:以GFPTNF交融卵白竞争结合实行,检测TBP和TRBP的特异性。用非变性PAGE检测TBP和TRBP的互补结合性。用细胞毒按捺实行,不雅察TBP和TRBP对TNF杀伤U937

2、细胞的按捺作用。用硝基蓝四氮唑NBT复本来领和RTPR技能,检测TBP和TRBP对TNF诱导的人外周血单核细胞的呼吸发作和对促炎症因子IL1和IL8RNA程度的按捺作用。结果:TBP和TRBP能按捺GFPTNF交融卵白与细胞膜上TNFR的结合。非变性PAGE证明,TBP与TRBP之间的结合,为非配体和受体的结合;TBP和TRBP对TNF的细胞毒效应均有按捺作用,且随着剂量的增长而加强,二者联用(即pep.38+X4)结果更好。TBP和TRBP联用,能有用地按捺TNF和IFN诱导的单核细胞呼吸发作的强度,按捺TNF诱导的IL1和IL8RNA的转录。结论:TBP和TRBP具有结合TNF和TNFR的

3、特异性,但二者的结合为非配体和受体的彼此结合。TBP和TRBP对TNF介导的种种生物学效应均具有按捺作用,二者联用结果更明显。关键词TNF;TNF结合肽;TNFR关闭肽肿瘤坏死因子TNF是一种重要由活化的单核/巨噬细胞产生的多效性细胞因子,可到场机体抗肿瘤、抗熏染、调治免疫应答及炎症反响等多种生理和病理历程1-3。在急性炎症反响中,TNF是一种起始的关键性的细胞因子,可诱导其他炎性细胞因子如IL1、IL6及IL8的表达,从而加剧炎症反响,引起发热、内毒素样休克等病症。在类风湿性枢纽炎、溃疡性结肠炎及多发性硬化等自身免疫性疾病的发病历程中,TNF也起关键性作用。因此,以TNF及TNFR为靶点方案

4、药物,可有用地阻断上述病理历程,到达治疗TNF相干的炎症性疾病的目的。本室曾别离以TNF和TNFRI为诱饵,从噬菌体随机环肽库中挑选出能与TNF结合的环九肽,即TNF结合肽TNFbandingpeptide,TBP和能与TNFR结合又不激活受体后反响的环九肽,即TNFR关闭肽TNFRblkingpeptide,TRBP4。本实行中进一步不雅察了TBP和TRBP对TNF介导的细胞毒效应、诱导IL1、IL8的表达,以及促外周血单核细胞呼吸发作的按捺作用,为研制TNF相干的抗炎药物奠基了基矗1质料和要领1.1质料STNF尺度品和TT为Siga公司产物。TRIzlRNA提取试剂为GIB公司产物。RTk

5、it为BI公司产物。TaqDNA聚合酶为bistar公司产物。PR引物为上海博亚公司产物。TBP和TRBP由西安美联公司合成并环化,纯度均为95%。绿色荧光卵白GFPTNF交融卵白由本室制备。人单核细胞株U937细胞和小鼠成纤维细胞株L929细胞,均由本实行室保存供实行利用。1.2要领2结果2.1TBP和TRBP按捺TNF和TNFR结合的作用利用流式细胞术和荧光显微镜技能证明,合成多肽能按捺GFPTNF交融卵白与细胞膜上的TNFR结合。此中,TBP(Pep.38)与TRBP(pep.X4)联用的按捺结果最好,能使U937细胞结合GFPTNF荧光卵白的阳性细胞率低落50%,并可明显减低L929细

6、胞膜上的荧光强度图1,提示人工合成的TBP和TRBP仍具有按捺TNF和TNFR结合的作用。图1TBP和TRBP对GFPTNF交融卵白与L929细胞TNFR结合的按捺作用略Fig1InhibitryeffetfTBPandTRBPnbindingfGFPTNFtTNFRnL929ells(200)A:GFPTNF;B:GFPTNF+unrelatedpeptided;:GFPTNF+(pep.38+pep.X4).图2TBP和TRBP及TBP加TRBP的PAGE阐发略Fig2SDSPAGEanalysisfTBP,TRBPandTBPplusTRBP1:pep.38;2:pep.X4;3:pep

7、.38+X4.图3TBP和TRBP对TNF介导的U937细胞毒效应的按捺作用略Fig3InhibitryeffetnyttxiityfU937ellsediatedbyTNF2.4TBP与TRBP对外周血单核细胞的影响利用NBT复原法检测表白,同时赐与外源性IFN和TNF别离为5g/L和5103U/L激活单核细胞的作用,显着强于单独的TBP和TRBP的作用,表示为呼吸发作的强度明显加强图4。TBP和TRBP联用,能有用地按捺TNF和IFN诱导的单核细胞呼吸发作的强度,使反响体系中NBT的复本来领削弱,A630值明显低落按捺率为56.25%。RTPR检测也证明,TBP和TRBP联用能按捺TNF诱

8、导的IL1和IL8RNA转录的程度图5。对RTPR产物电泳后出现的条带举行扫描表现,其对IL1和IL8RNA转录的按捺率别离为55.10%和52.53%。上述结果表白,TBP和TRBP可通过竞争性地按捺TNF与TNFR的结合,低落单核细胞对IFN刺激的敏感性而按捺其活化。图4TBP和TRBP对TNF和IFN诱导的外周血单核细胞呼吸发作的影响略Fig4TheeffetfTBPandTRBPnrespiratryburst(RB)fperipheralbldnytesinduedbyTNFandIFN3讨论本课题组曾经以TNFRI为诱饵从噬菌体随机线肽库中挑选出TRBP含14个氨基酸的线肽5,6。

9、体外实行证明,其对TNF的生物学效应具有按捺作用;但是据文献报道,环肽与线肽比拟具有较庞大的构象、不变好、生物半衰期长等长处7。因此,本课题组又别离以TNF和TNFRI为诱饵,从噬菌体随机环肽库中挑选TBP和TRBP环九肽,本研究通过体外实行进一步证明了其生物学成效。将噬菌体展示的肽举行人工合成,有大概其空间构象产生改变而影响其效应。因此,起首必需证明TBP和TRBP是否仍旧保存了其别离结合TNF和TNFR的特性。本研究中,我们用流式细胞术和荧光显微镜技能证明,两种合成肽通过别离与TNF和TNFR结合,而竞争性地按捺GFPTNF与细胞膜上TNFR的结合,从而使GFPTNF+的U937细胞的比率

10、低落,荧光强度显着削弱。以上提示,TBP和TRBP与噬菌体上展示的肽一样,仍具有别离结合TNF和TNFR的活性。本实行中进一步检测了TBP和TRBP对TNF细胞杀伤效应的按捺作用。结果表白,TBP和TRBP对TNF的杀伤效应均有按捺作用,并随着剂量的增长而加强,并且TBP和TRBP联用(pep.38+pep.X4)的按捺结果更佳,这些结果表白,合成肽与噬菌体展示的肽一样,同样具有按捺TNF杀伤靶细胞的效应。本实行证明,别离用5g/L和5103U/L的外源性IFN和TNF,就可诱导人外周血单核细胞的呼吸发作及IL1RNA和IL8RNA的转录。但TBP和TRBP可通过竞争地按捺TNF与人外周血单核

11、细胞外貌TNFR的结合,低落单核细胞对IFN的敏感性,从而按捺单核细胞的活化,表示为呼吸发作强度显着削弱,复原NBT的本领低落;及使单核细胞中IL1和IL8等RNA的程度落落。参考文献:1BeatlerB,eraiA.ahetinandTNFastsidesfthesaebilgialinJ.Nature,1986,320(6063):584-588.2BeutlerBA.TherlefturnersisfatrinhealthanddiseaseJ.JRheuatlSuppl,1999,57:16-21.3VanderPllT,LrySF.TNFinsepsis:ediatrfultiplerganfailureressentialpartfhstdefenseJ.Shk,1995,3(1):1-12.4尹丙姣,王晶,喻明霞,等.TBP和TRBP的挑选及其特异性断定J.华中科技大学学报医学版,2022,346:660-663.5何亚萍,尹丙姣,李卓娅,等.TNF受体关闭肽对大鼠腹腔巨噬细胞成效的影响J.中国免疫学杂志,2022,6(19):385-388.6YanfaskySD,BaldinDN,ButlerJH,etal.Highaffinitytyp