第六章酶化学课件

1、第六章第一部分酶化学本部分内容： 酶的概述 酶的作用机制 酶促动力学 酶的应用及发展 酶的概述一、酶催化作用的特点二、酶的化学本质及组成三、酶的命名与分类四、酶的结构与功能的关系酶(Enzyme)的概念: 酶是活细胞产生的，具有催化生物反应功能的蛋白质大分子及核酸。 酶的概念一、酶催化作用特点：与一般化学催化剂相比，其共性有：1、用量少而催化效率高；2、不改变化学反应的平衡点；3、可降低反应的活化能：酶的概念活化能(Activation energy)：分子由常态转变为活化状态所需的能量。在一定温度下1mol 底物全部进入活化态所需要的自由能。（一）催化效率高：通常要高出非生物催化剂催化活性的

2、1061013倍。2H2O22H2O + O21mol过氧化氢酶 5106molH2O21molFe+2 610-4molH2O2（二）、具高度专一性 一种酶只能催化一种或一类十分相似的反应。底物（substrate ，S)：酶作用的物质。绝对专一性：只作用一种底物。相对专一性：作用于一类底物。酶作用的专一性 酶的专一性：一种酶仅能作用于一种底物，或一类分子结构相似的物质，并催化某种类型的反应。这种特性称为酶的专一性，又叫做酶的特异性或选择性。酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性族（基团）专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。RCOO- +R OH + H+酯

3、酶：RCOR + H2OOOCH2OHOHOHOH15-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ ROH绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶：H2NCNH2 + H2OO2NH3 + CO2胰蛋白酶的基团专一性消化道几种蛋白酶的专一性立体异构专一性酶只能催化一种立体异构体发生某种化学反应，而对另一种立体异构体则无作用。（三）、酶易失活：凡使pr变性的因素都可使酶破坏,酶在温和条件下作用。 （四）、酶活性受多种方式调控：如：抑制剂、反馈抑制、酶原激活、激 素等。（五）、有些酶的活性与辅酶、辅基 及金属离子有关。除去，酶失活。酶的概念二、酶的化学本质1、大多数酶是蛋白质：元素组成与

4、分子量 化学结构与空间结构；理化性质:两性性质；胶体性质；变性失活；可被蛋白酶分解；结晶；测序。2、某些RNA具有催化活性,将本质为RNA 的酶称核酶（ribozymes)。酶的概念三、酶的命名与分类（一）酶的命名酶的命名有两种方法：系统名、惯用名惯用名：命名原则根据酶催化反应的性质来命名。如催化水解反应的酶-水解酶 催化氧化反应的酶-氧化酶或脱氢酶 催化转移氨基的酶-转氨酶根据被作用的底物兼顾反应的性质来命名。根据酶的来源命名。如细菌淀粉酶、胃蛋白酶。酶的命名与分类系统名:根据酶催化反应的类型分为六大类：分别用1，2，3，4，5，6编号1、氧化还原酶类 2、转移酶类 3、水解酶类 4、裂分酶

5、类 5、异构酶类 6、合成酶类根据底物的性质和反应键的性质，每一类又可分为若干亚类及次亚类。仍然用1，2，3，编号。在次亚类中编号。：乳酸脱氢酶 EC 1. 1. 1. 27EC(Enzyme Commision)第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号 每个酶有两个名称：系统名、惯用名惯用名：简单、便于使用；系统名：明确标明酶的底物及催化 反应的性质。酶的命名与分类（二）酶的分类1、根据酶的组成分类：（1）、单纯酶（简单蛋白质）： 其活性仅取决于其蛋白质结构。 如：蛋白酶、淀粉酶等。酶的命名与分类（2）结合酶：酶蛋白+辅因子=全酶 辅

6、因子(cofacter)：热稳定的非蛋白小分子。按分子组成： 金属离子：Mg2+、Mn2+ 小分子有机物：NAD + 、NADP + 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸按与酶的结合程度:辅酶(coenzyme): 结合较松，可透析去除； 辅基(prosthetic grup)： 结合较紧，透析不易除去。酶蛋白负责专一性；辅因子负责电子、原子或基团转移。 同一辅因子可与多种不同酶蛋白结合，显示不同催化活性。2.按酶的分子特点分：（1）、单体酶：一条肽链构成。（2）、寡聚酶：几条到多条肽链（相同或不同） 组成。（3）、多酶体系：几种酶彼此嵌合的复合体， 有利于一系列反应连续进行。 3.

7、国际酶学委员会(Enzyme Commision)根据酶催化反应的类型分类 （1） 、氧化还原酶 （2）、转移酶 （3）、水解酶 （4）、裂解酶 （5）、异构酶 （6）、合成酶酶的命名与分类酶的编号EC 为 Enzyme Commision 酶学委员会缩写 酶的命名与分类（一）酶的分类1. 氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。AH2 + B（O2）供氢体 受氢体A + BH2（H2O2，H2O）根据受氢体的性质，氧化还原酶类可分为：（1）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2 +BA +BH2（需辅酶或辅酶）（2）氧化酶类催化底物脱氢，氧化生成H2O2：AH2 +

8、O2A + H2O2（需FAD或FMN）催化底物脱氢，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（3）过氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2（其它） （4）加氧酶（双加氧酶和单加氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（顺，顺-已二烯二酸）2. 转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。AX + BA +BX根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基（激酶）和含硫基的酶。 已糖激酶 葡萄糖 + ATP - 6磷酸葡萄糖 + ADP Mg+水解酶类：催化加水分解作用。 AB + H2O AOH + BH4. 裂解酶类：催化非水解性地除去基

9、团而形成双键的反应或逆反应。CH3C=OCOOHCC键CH3C=OH+ CO2 （脱羧酶、醛缩酶）CO键CH2COOHHOCHCOOHHCCOOHHOOCCH+ H2O（脱水酶）CN键COOHCHNH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+ NH3（脱氨酶）5. 异构酶：催化 各种异构体之间的互变。AB常见的有消旋和变旋、醛酮异构、顺反异构和变位酶类。6. 合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。A + B + ATPAB + ADP +Pi四、酶的结构与功能的关系一、酶的活性中心（一）酶的活性中心概念：活性中心：酶分子中能同底物结合并起催化作用的空间部位。羧肽酶的活性中心实验：酶蛋白经水解切

10、去部分肽链后，残留部分仍有活性。说明：参与催化反应的只是其中一小部分，即活性中心。活性中心的实质活性中心即酶分子中在三维结构上相互靠近的几个aa残基或其上的某些基团。活性中心以外的部分对酶催化次要但对活性中心形成提供结构基础。胰凝乳蛋白酶的活性中心（三）活性中心的特点：1、仅为酶体积的很小部分；2、具有一定的空间构象；3、S与E靠次级键结合；4、是由特定空间构象维持的一个裂隙。酶促反应机理溶菌酶活性中心（四）研究酶活性中心的方法：1、通过研究专一性底物判断确定E活性中心的结构；2、用化学修饰法共价修饰E分子的一些功 能基团，以查出哪些基团是活性必需的；3、X-衍射直接探明活性中心。酶促反应机理

11、二、酶原的激活没有活性的酶的前体称为酶原。酶原转变成有活性的酶的过程称为酶原的激活。这个过程实质上是酶活性部位形成和暴露的过程。在组织细胞中，某些酶以酶原的形式存在，可保护分泌这种酶的组织细胞不被水解破坏。胰蛋白酶的激活缬天天天天赖异缬甘组SS丝SS肠激酶（激活作用）缬天天天天赖异甘组SS丝缬SS活性中心胰蛋白酶原胰蛋白酶提问：为什么不直接以酶形式存在呢？答案：保护正常组织不受伤害。活性部位三、同工酶(isoenzyme)能催化相同的化学反应，但在蛋白质分子的结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。乳酸脱氢酶（LDH）MHMMMMM4HMMMM3HMMHHM2H2MHHHMH3H

12、HHHH4抗体酶既是抗体又具有催化功能的蛋白质. 酶的作用机制 酶的催化作用，过渡态，活化能中间产物学说决定酶作用专一性的机制过渡态互补抗体酶使酶具有高催化效率的因素一 酶的催化作用与分子活化能化学反应自由能方程式G =H -TS（ G是总自由能的变化， H 是总热能的变化，S是熵的变化）当G0，反应不能自发进行。当G0，反应能自发进行。活化能：分子由常态转变为活化状态所需的能量。是指在一定温度下，1mol 反应物全部进入活化状态所需的自由能。促使化学反应进行的途径：用加热或光照给反应体系提供能量。使用催化剂降低反应活化能。酶和一般催化剂的作用就是降低化学反应所需的活化能，从而使活化分子数增多

13、，反应速度加快。酶与底物间的作用酶的作用机制二. 中间产物学说：1、学说认为：当酶催化一化学反应时，首先 E和 S结合形成中间产物 ES，然后它再分解成产物P并释放酶E。S + E ES E + P酶的作用机制2、中间产物1）中间产物比底物需较少的活化能就可分解成产物并放出酶。2）ES 决定酶促反应速度。3）中间产物形成的实验依据：1.同位素32P标记底物法（磷酸化酶与葡萄糖结合）；2.吸收光谱法（过氧化物酶与过氧化氢结合）。酶的作用机制羧肽酶A的结构由于结合了底物而改变A:未结合底物B:E-S中间复合物酶的作用机制三、决定酶作用专一性的机制（一）锁钥学说：1894年E.Fischer 提出：

14、S分子或其一部分像钥匙一样楔入E活性中心部位。 此学说强调E与S结构互相吻合(刚性模板)。酶的作用机制（二）诱导契合学说1958年Koshland 提出：当E与S接近时，E蛋白受S分子的诱导，其构象发生有利于S结合的变化，E与S在此基础上互补契合、进行反应。酶的作用机制四. 过渡态互补： Pauling提出过渡态理论认为： E与S的过渡态互补，亲和力最强，释放的结合能使反应活化能降低，有利于S 跨越能垒，使反应加速。证明：人工合成了过渡态类似物； 用过渡态类似物制备出抗体酶。酶的作用机制五. 使酶具高催化效率的因素：1. 邻近定向效应： S分子向E活性中心靠近，且趋向E催化部位，使活性中心这一

15、局部区域S增加，并使S分子发生扭曲，易于断裂，降低反应所需活化能。从而加快反应速度。2.“张力”和“形变”：X衍射证实：E使S分子中敏感键中某些基团的电子密度变化，产生电子张力，使其发生变形，更易于断裂。酶高效的因素A：S变形B：S和E都变形3. 酸碱催化：指E分子上某些基团作为质子供体和质子受体对S进行（广义的）酸碱催化。1、醛的水合作用2、肽的水解作用酶高效的因素4. 共价催化： E分子中的亲核基团提供电子，对S中亲电子的碳原子进行攻击，生成ES使反应活化能降低，S可越过较低的能垒而形成产物。酶高效的因素酶促反应动力学一：酶活力的测定： 1. 酶活力（酶活性enzyme activity)

16、: ： 指酶催化一定化学反应的能力。 用酶所催化的某一化学反应速度的快慢来表示酶的含量和存在。酶促反应速度的测定：（1）测定单位时间底物的消耗量（2）测定单位时间产物的生成量2.表示方法：（1）、酶活力单位（active unit, U，I.U）： 特定条件下（25 ），在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量。（2）、酶的转换数（katal，kat）： 在最适条件下（30 ）,每秒钟可使1mol底物转化的酶量。 1 kat = 6107 I.U酶促反应动力学（3）、酶的比活力： 指每mg酶蛋白所具有的酶活力，一般用 U/ mg蛋白表示。 （4）、用反应初速度（ v ） 来表示： 测单位时间内、单

17、位体积中底物减少 或产物增加量来表示 浓度/单位时间.酶促反应动力学二、影响酶促反应速度的因素酶促反应动力学是研究酶促反应的速度及影响此速度的各种因素的科学。1.酶浓度对酶作用的影响 在底物足够过量，不含抑制酶活性的物质及其他不利于酶发挥作用的因素时 V=k E 酶促反应动力学（二）酶浓度对酶作用的影响在有足够底物和其他条件不变的情况下： v = k E 本人认为不完善 v0 = k E原因：1.逆反应速度增加2.底物浓度下降3.酶会因环境因素的影响而失活4.产物成为酶的抑制剂2 底物浓度对酶作用的影响SvVmax一级反应 v = k S零级反应 v = k E米氏方程 Michaelis &

18、 Menten根据中间产物学说推导出表示酶促反应中底物浓度与反应速度关系的公式称 。米氏方程：Km + SV S=酶促反应动力学米氏方程的推导：根据中间产物学说： 式中K1,K2,K3分别为各反应常数，可知： ES形成速度= K1 E S ES分解速度=(K2, + K3 ) ES当反应达恒稳态时,二速度相等,即: K1 E S =(K2, + K3 ) ESS + E ES E + PK1K2K3酶促反应动力学整理并令：由于E 与ES之和为总的酶浓度Et ,即: Et= E + ES E = EtES将代入:ESK1= =E S (K2, + K3 )KmES=(EtES)SKm酶促反应动力

19、学整理得:酶促反应速度由ES决定,而= K3 ES ES=将代入整理得:ES=EtSKm+SK3=EtSKm+SK3此时达到最大反应速度Vmax: Vmax= K3 Et 将代入,得米氏方程:当S 升高,所有E为S所饱和时,即: Et =ES=SKm+SVmax酶促反应动力学米氏方程的变化：a、 Km S 时： =VS/ Km 初速度与S成正比的一级反应。b、若SKm 时： =V 零级反应c、若S = Km 时： =1/2V 酶反应速度与S的关系米氏常数Km的意义a、概念： 反应速度为最大反应速度一半时的底 物浓度。b、单位： mol/L 或 mmol/L c、意义： Km是酶的特征性物理常数

20、。 只与E性质有关，与E无关；测Km可鉴别酶。 在一定条件下某酶对某一底物有一定的Km值。 因此，测某酶的Km数值，可鉴别酶。酶促反应动力学同一E有几个S就有几个Km， Km最小的为最适S或天然S。Km大，E与S亲和力弱； Km小， E与S亲和力强。d、实际用途： 1）可由所要求的V求S；例：求反应速度达最大反应速度99%时的底物浓度 2）根据已知S求该反应V。99%V=VSKm +S=S99Km酶促反应动力学测米氏常数的方法：将米氏方程两侧取倒数，以1/对1/S作图得直线,得Lineweaver-Burk方程：Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法）Km求法: 1、量截距； 2、

21、量一个截距求斜率酶促反应动力学3.温度对酶作用的影响在一定范围内（0-40） E活性随温度上升而加快；温度达到一定高度（60 以上）E活性不再增高，反而下降。酶的影响因素(1)、酶促反应最适温度： 酶促反应速度达到最大时的温度。 因E种、E源不同而异。 (2)、温度影响酶促反应的机理：1）低于最适温度：反应速度随温度上升而加快；2）高于最适温度：E蛋白随温度上升而变性失活。酶的影响因素例1、 蔬菜干制 (霸王花、黄花菜) 酶促褐变条件：酚酶、酚类底物、O2例2、 加工豆奶 豆腥味产生条件：脂氧化酶、油脂、O2例3、 加工绿茶 工艺：鲜叶 杀青 揉捻 干燥红茶加工工艺：鲜叶 萎雕 揉捻 发酵 干

22、燥4.pH对酶作用的影响(1)、最适pH： 超出则酶活下降。植物、微生物： 最适pH： 4-6.5 ；动物： 最适pH：6.5 -8为酶特性之一、受各种因素影响。酶的影响因素(2)、 pH影响的机理：1）pH影响E活性中心及附近有关基团的解 离，使之易或不易与S 结合；2）pH影响S的极性基团，从而影响这些基 团与E的结合；3）过酸、过碱可使酶变性失活。酶的影响因素5.激活剂对酶作用的影响(1)、概念：凡能提高酶活力的物质称激活剂。 (2)、种类：1）无机离子的激活作用： 作为活性部位的组分； 作为辅助因子的组分； 由无机离子与E、S或ES结合引起。 如：Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+

23、等。酶的影响因素2）中等大小的有机分子： 包括还原剂（使二硫键还原）、 EDTA（去除重金属杂质）等。3）蛋白质类大分子物质： 激活酶原、解除抑制剂的抑制作用。如：pr与重金属离子结合，解除抑制剂的 抑制。酶的影响因素6.抑制剂(1)、概念：抑制剂（inhibitor, I ) ： 凡与E结合后，使E的活性部位结构和性质改变而引起 E活性降低或丧失的物质，叫 。抑制作用(inhibition)： 任何使E活性降低或丧失的作用统称为.酶的影响因素(2)、抑制作用的类型：1）不可逆抑制： 通常 I 以较牢固的共价键与E蛋白中的基团结合，引起E失活。透析、超滤不能除去 I 。酶的影响因素不可逆抑制剂

24、：有机磷、烷化剂：作用于Ser、Thr的-OH； 如：有机磷农药、二战毒气等作用于催 化乙酰胆碱水解的胆碱酯酶，引起 一系列神经中毒症状； 临床用羟肟酸缓解症状。常用农药:有机磷农药、有机氯农药、有机汞农药抗菌素: 酶的影响因素2）可逆抑制：I与E的结合往往是非共价键结合，是可逆结合，可用透析法除去I。可逆抑制根据I与S的关系分三类： 竞争性抑制： 非竞争性抑制： 反竞争性抑制：酶的影响因素竞争性抑制： I 在分子结构上与S类似， I与S竞争性与E结合，使酶促反应速度下降。 但，若S高，则此效应减小。酶的影响因素反应通式： E + S S E E+P + I EI特点：I与S结构类似；抑制程度

25、取决于 I和S以及与E的亲和力；可通过增加S来减轻或解除抑制。竞争性抑制机理：I占了S的位子； E与I或S结合后构象发生变化，产生不利于另一个结合的构象。应用：药物设计的依据。如磺胺、对氨基苯甲酸(PABA)对氨基苯磺酰胺非竞争性抑制：S与I可同时结合在酶的不同部位上，形成ESI，因此酶活性降低。此类 I 与E活性中心以外的基团结合，其结构可能与S无关。酶的影响因素特点：通过I与E的结合，改变酶结构和性质；Vmax减小；抑制取决于 I。非竞争抑制的通式反竞争性抑制作用：抑制剂必须在酶与底物结合后才能进一步形成ESI复合物。S + EESE + P + IESIE+Pv = V1 + Iki S

26、km1+ Iki+ SSvkmkm三者动力学区别竞争性抑制：Vmax不变；Km增大， 增加S可克服。非竞争性抑制： Km 不变； Vmax减小， 增加S不可克服。 反竞争性抑制: Vmax减小;Km减小7.别构效应(1)、概念： 亦称变构酶，是一类重要的调节酶。 一般为寡聚酶（两个以上亚基组成），易发生构象改变。其上有二个重要部位： 活性部位和别构部位Asp转氨甲酰酶(2)别构酶结构的部位1）活性部位： 负责E对S的结合与催化；2）别构部位： 可结合调节物，负责调节酶反应速度 。 这两部位可在不同亚基或同一亚基不同部位上。酶活性的调节(3)、别构效应：1）概念： 当S或S以外的物质与E的别构部

27、位非共价 结合后，通过E分子构象的变化影响E催化 活性的效应称 。 酶活性的调节2）别构效应剂：引起别构效应的物质。分两种：别构激活剂： 正协同，加快反应速度的，多为S 。 如：ATP对ATCase(天冬氨酸转氨甲酰酶)。别构抑制剂： 负协同，减慢反应速度，多为代谢终产物。 如：CTP对ATCase。酶活性的调节别构酶通常为代谢途径第一个酶或分支点上第一个酶。3、别构酶动力学曲线：大多数别构酶不符合米氏方程。1、非调节酶曲线2、正协同别构酶3、负协同别构酶曲线2中S的变化所引起的速度变化的反应几乎是“全”或“无”酶的应用与发展分离纯化酶的应用一、酶的分离纯化（一）目的： 1、为了研究酶的理化性

28、质或鉴定酶； 2、作为生化试剂或药物。（二）根据酶在体内作用的部位分： 胞外酶、胞内酶；（三）步骤： 选材破碎抽提分离纯化保存酶在细胞中的分布： 胞外酶：水解酶类，易收集，不必破碎细胞，缓冲液或水浸泡细胞或发酵液离心得到上清液即为含酶液。 胞内酶：除水解酶类外的其它酶类，需破碎细胞，不同的酶分布部位不同，最好先将酶存在的细胞器分离后再破碎该细胞器，然后将酶用适当的缓冲溶液或水抽提。 原则： 在增加酶得率和纯度的同时，尽可能避免高温、过酸、过碱、剧烈的震荡及其它可能使酶丧失活力的一切操作过程。尽最大可能保存酶的活力。分离提纯：1.酶的抽提：将酶溶解出来就称为抽提。 胞外酶：固体培养的菌体加水或适

29、当缓冲溶液浸泡过滤即可。液体培养的菌体将发酵液离心分离除去菌体收集离心液即可。 胞内酶：先破碎细胞，再用水或适当的缓冲溶液抽提。 2.酶的纯化： 纯化的关键是维持酶的活性，因为随着酶的逐渐提纯，一些天然的可保持酶活力的其它成分逐渐减少，酶的稳定性变差，所以整个纯化过程应维持低温。（1）酶的沉淀方法：与蛋白质的沉淀方法相同，常用：A盐析法：常用硫酸铵盐析，有分段盐析和一次性盐析两种方法。B有机溶剂沉淀法：用乙醇、丙酮等。应低温操作，溶剂少量分批加入。（2）酶的纯化方法：有吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。3.酶的结晶：纯化以后的酶液再次沉淀，仍采用沉淀法。4.酶的保存：一般在-2

30、0以下低温保存。 注意： 低温；0-5，有机溶剂在-15 -20； 加EDTA，防止金属离子使酶失活； 加巯基乙醇，避免酶蛋白巯基氧化失活； 不要过度搅拌。应常测酶活。酶的分离纯化 酶的应用工业上酶应用的优点：专一性高，副反应很少，后处理容易。催化效率高，酶用量少。反应条件温和，可以在近中性的水溶液中进行反应。4.酶的催化活性可以进行人工控制。缺点：1.酶易失活，酶反应的温度、PH、离子强度等要很好控制。2.酶不易得到，价格昂贵。3.酶不易保存。1、酶在工业中的应用不断扩大。酶在食品工业的应用： 1)、酿造米酒 浸米蒸饭拌曲装缸糖化发酵压榨成品 酒曲2)、果葡糖浆酶法生产： 液化酶 糖化酶 葡萄糖异构酶 淀粉乳-糊精-葡萄糖