《药剂学》第十五章课件

1、第十五章生物技术药物制剂章节目录第一节 概述第二节 蛋白多肽类药物制剂 第三节 寡核苷酸及基因类药物制剂第四节 疫苗制剂2.熟悉蛋白多肽类药物不稳定性的表现3.了解蛋白多肽类药物的新型递送系统；寡核苷酸、基因类药物及疫苗的输送生物技术药物的概念及特点；蛋白多肽类药物稳定性影响因素及其制剂稳定化方法1.掌握章节目标生物技术药物（biotechnological drug）是指采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来制备的用于人类疾病预防、治疗和诊断的药物。包括活性蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体、核酸及细胞因子类药物。同时与小分子化学药物相比，生物技术药物的分子量大，故而也被称为生

2、物大分子药物。（一）生物技术药物第一节 概述目前市场上的药物仍以小分子化学药物为主体，但是生物技术药物的数量及占比正不断地增加，而且预计这一趋势还将持续。如Humira（修美乐）从2012年荣登全球销售额排行榜榜首，至今已经连续7年蝉联销售冠军，截止2018年底累计销售额高达1328.78亿美元。（二）生物技术药物现状第一节 概述2017年全球销售额居前20名的药物中有12个为生物技术药物，其中7个生物技术药物的销售额位列前10名；2018年的全球药物销售额前10名的药物中有8个生物技术药物；2019年的全球药物销售统计数据也显示了相似的情况。（二）生物技术药物现状第一节 概述1）大部分生物技

3、术药物都必须采用静脉注射方式给药；2）大多数生物技术药物的物理性质和化学性质均不稳定；3）与小分子化学药物制剂相比，生物技术药物制剂的研发过程中需要依靠多种不同的分析手段来表征生物技术药物的特征；4）有些生物技术药物需要运用特殊的递送技术才能发挥药效。（三）生物技术药物特点第一节 概述蛋白类药物通常是利用哺乳动物细胞、酵母细胞和细菌来进行制备；制备过程中，在编码所需目标蛋白的基因被人工插入细胞后，将细胞置于大型发酵罐中培养，在特定时期将细胞酶解，采用离心、过滤及柱色谱的方法，将细胞中所含的目标蛋白多肽分离纯化；制备完成后，还应当利用多种分析手段（如毛细管区带电泳等）对蛋白和多肽类药物进行表征，

4、以确定其特性和纯度。（一）蛋白质多肽类药物的生产第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白质和多肽具有相同的化学组成，均由常见的20种基本氨基酸通过肽键连接而成。通常将：分子量1 kD且5 kD、具有三维结构的大分子称为蛋白质。（二）蛋白质多肽类药物的结构与理化性质第二节 蛋白多肽类药物制剂 溶解性：当溶液的pH远离蛋白多肽的等电点时，蛋白质多肽的溶解度增加；除pH之外，离子强度也是影响蛋白质水溶性的因素之一，其影响也被称为盐析作用。造成盐析作用的原因主要有两点：盐类较蛋白质更易被水化；盐类对于水表面张力的影响。（二）蛋白质多肽类药物的结构与理化性质第二节 蛋白多肽类药物制剂 （三）蛋白质多肽类药物的稳

5、定性第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白质主要物理和化学降解途径示意图脱酰胺反应过程：多肽、蛋白序列中谷氨酰胺或天冬酰胺侧链上的酰胺基被水解，形成游离羧酸根，攻击肽链，形成一个对称的丁二酰亚胺结构，丁二酰亚胺进一步水解为天冬氨酸或者异天冬氨酸。许多蛋白质多肽结构发生改变都归因于脱酰胺反应。这一反应在天冬酰胺连接甘氨酸时尤易发生。天冬氨酸与甘氨酸直接相连时也会发生类似的反应，导致异天冬氨酸的部分结构变化。化学不稳定性脱酰氨反应第二节 蛋白多肽类药物制剂 氧化反应的位点：蛋白质多肽氨基酸侧链中甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸的侧链都是可能发生氧化反应的位点，尤其是甲硫氨酸，可被空气氧化。氧化

6、反应的速率与溶液的pH有关，如甲硫氨酸的氧化反应发生在中性pH区间内。引发氧化反应的因素有很多，除了空气中的氧，还包括金属离子、自由基、光照等。 化学不稳定性氧化反应第二节 蛋白多肽类药物制剂 巯基、二硫键和它们之间的相互作用对大部分蛋白的性质具有重要影响，二硫键间的交换会引起蛋白质三维结构的变化，并导致其丧失活性。在常规中性pH溶液中二硫键是相对稳定的，但是在特定工艺以及贮存条件下，二硫键会发生断裂和重排组合。在碱性和酸性介质中，二硫键交换反应的机制是不同的。化学不稳定性二硫键断裂或交换第二节 蛋白多肽类药物制剂 聚集是蛋白质物理不稳定性的主要表现之一。蛋白质发生聚集后可能会导致药物溶解度减

7、小、活性丧失或降低、免疫原性改变。蛋白质表面吸附的直接后果就是剂量损失，使实际到达患者体内的蛋白质药物量减少；另一个后果是由于表面吸附引起蛋白质的物理状态变化，如去折叠，从而导致蛋白质变性和失活沉淀指肉眼可见的蛋白质从溶液中析出的过程。通常在这种情况下蛋白质已发生部分或完全去折叠，并且这种行为是不可逆的。物理不稳定性第二节 蛋白多肽类药物制剂 影响稳定性的因素包括：温度、pH、蛋白质浓度、离子环境、表面、机械作用力等。蛋白质的稳定性是破化其稳定性和增加其稳定性两种作用力相互平衡的结果。促进蛋白质稳定化也就是维持蛋白质折叠的作用力一般很弱，包括疏水作用、静电作用（电荷排斥和电子对）、氢键及范德华

8、力等。影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素第二节 蛋白多肽类药物制剂 影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素第二节 蛋白多肽类药物制剂 影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素第二节 蛋白多肽类药物制剂 影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素第二节 蛋白多肽类药物制剂 影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素第二节 蛋白多肽类药物制剂 影响蛋白多肽类药物分子稳定性的因素第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白质多肽类药物制剂主要采用注射方式给药，因此，它们通常被制备成液体注射液或注射用冻干粉针制剂。然而蛋白多肽类药物分子对制剂生产、贮存、分装和使用过程中的许多促降解因素都很敏感，如何在蛋白多肽类药物的整个供应链中保持其物理

9、和化学稳定性就成为了制剂研究人员面临的主要挑战之一。（四）蛋白多肽类药物制剂及其稳定化方法第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白质与多肽类药物制剂的稳定化方法主要有以下三种：对容易发生降解的氨基酸进行置换；加入稳定剂改变蛋白质所处的外在环境；通过干燥等固化蛋白质的手段，降低其降解概率。蛋白多肽类药物制剂的稳定化方法第二节 蛋白多肽类药物制剂 氨基酸的置换修饰：通过置换或加固一些易降解的氨基酸残基，蛋白质的结构可以变得更加稳固。氨基酸的置换修饰主要对提高酶蛋白的酶活力和增加酶蛋白的稳定性有一定的作用。例如：甘精胰岛素不足处：这一方法可能会使蛋白质的功能和免疫原性发生较大改变。氨基酸的置换修饰第二节 蛋

10、白多肽类药物制剂 筛选合适的溶剂或稳定剂，是制剂研究人员提高蛋白质多肽类药物分子稳定性的主要手段之一。目前有几种描述共溶剂或其它稳定剂提高蛋白质稳定性的机制，其中被引用最为广泛的就是优先结合理论。添加稳定剂第二节 蛋白多肽类药物制剂 第二节 蛋白多肽类药物制剂 稳定剂的种类稳定机制具体应用辅料缓冲液保持蛋白质溶液pH恒定，防止化学降解磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲溶液，醋酸盐缓冲液等糖类及多元醇增加水分子的表面张力，导致辅料从蛋白质分子表面优先排出，从而致使蛋白质优先水化葡萄糖、海藻糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘油、赤藓糖醇表面活性剂降低蛋白质溶液的表面张力，从而降低蛋白质在疏水界面吸附及聚集的驱动

11、力泊洛沙姆188、泊洛沙姆407，吐温80、吐温20等盐类增加与蛋白质接触的水的表面张力，使疏水基团远离水分子从而强化蛋白质内部的疏水相互作用氯化钠、氯化钾聚合物优先排除作用，通过空间位阻防止蛋白质间的相互作用，增加溶液黏度，限制蛋白质结构变形血清白蛋白，HPMC、PEGs、HP-CD、右旋糖酐等金属离子与蛋白质结合，使其结构更紧固和稳定Zn2+、Ca2+、Mn2+、Mg2+等氨基酸优先排出作用，还可降低一些化学降解His、Gly、Met等抗氧剂优先结合氧化性物质，防止蛋白质氧化维生素C、硫磺盐、枸橼酸等表15-4 常用的稳定化辅料及其稳定化机制冷冻干燥通常作为蛋白多肽类制剂干燥的首选方法，主

12、要包括蛋白质多肽溶液的预冻和在真空状态的干燥两个步骤。冷冻和干燥过程中存在多种可能使蛋白质发生变性的因素，如低温、冷冻和干燥等。为减少各种因素的不利影响，冷冻干燥处方中除了加入液体制剂中常用的稳定剂外，还需要添加冻干保护剂、填充剂等药用辅料。蛋白质的干燥第二节 蛋白多肽类药物制剂 第二节 蛋白多肽类药物制剂 保护机制药用辅料（1）水替代假说：冻结过程中，保护剂通过增加水分子的表面张力，促使蛋白质分子优先与水分子相互作用，保护了蛋白质天然构象；在升华过程中，保护剂的羟基与蛋白质的表面形成氢键，以取代干燥过程中失去的水分，使蛋白多肽继续受到氢键的保护 （2）玻璃态假说：蛋白质分子被保护剂包围，形成

13、无定形玻璃态，这种状态与液更加类似，其特有的刚性和惰性能使蛋白多肽在其中以分子状态分散，从而阻止蛋白多肽分子的运动、聚集和变性糖类：葡萄糖、果糖、海藻糖 、蔗糖、麦芽糖、右旋糖苷、HP-CD等；多元醇类：甘露醇、聚乙二醇；氨基酸类：甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸等；聚合物类：HPMC、人血清白蛋白等；其他：缓冲盐、表面活性剂等表15-7 蛋白质和多肽制剂常用的冻干保护剂及其作用机制注射给药方式能确保蛋白多肽类药物体内快速起效、药效强、生物利用度高以及具有可行的药动学和药效学行为。缺点为：侵袭性、血浆半衰期短、顺应性差。近年来研究者们尝试了多种新型制剂手段。这些手段可以分为两类：1）仍是

14、蛋白质和多肽类药物注射制剂，但改变了其药物动力学特性；2）采用非注射型蛋白质和多肽类药物递送系统。（五）蛋白多肽类药物的递送 第二节 蛋白多肽类药物制剂 （五）蛋白多肽类药物的递送 第二节 蛋白多肽类药物制剂 种类策略制剂手段注射型降低给药频率：延长蛋白多肽类药物的血浆半衰期或溶出速率化学修饰（糖基化、PEG化、脂肪酸酰化、蛋白融合、氨基酸置换等）；贮库给药系统（植入、微粒、原位贮库、智能递药等）；蛋白质结晶或沉淀非注射克服生物膜的吸收屏障、保护蛋白多肽药物稳定性等口服递药（采用乳剂、微囊、微球、脂质体等剂型或增加吸收促进剂、酶抑制剂、生物黏附剂等）；肺部递药（气雾剂、喷雾剂、干粉雾剂等将药物

15、输送至肺泡组织）；鼻腔递药（气雾剂、滴鼻剂、粉雾剂）；口腔递药（采用片剂、粉剂、喷雾剂等通过口腔黏膜直接进入体循环，避免了肝脏首过作用）；经皮递药（采用离子导入法、电穿孔法、高速微粉给药技术等）表15-9 近几年采用的蛋白多肽类药物新型制剂手段化学修饰 是指运用化学合成或蛋白工程技术手段，在蛋白质和多肽类药物分子上嫁接一些化学基团或改变其肽链上的氨基酸，从而对蛋白质和多肽类药物分子进行化学改变的方法。化学修饰法主要包括：PEG化、糖基化、脂肪酰化、蛋白融合等。这些方法均可延长蛋白多肽类药物的血浆半衰期或增强其药效。 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-化学修饰 第二节 蛋白多肽类药物制剂 PEG修

16、饰 PEG修饰可增加药物的亲水性，减少肾脏对药物的滤过作用，同时能掩盖酶位点，降低生物降解速率，达到长循环作用。缺点：PEG在进行多位点修饰时，非定点修饰具有随机性，专一性差，定点修饰则由于蛋白质结构复杂而不易控制条件，甚至可能导致生物活性降低。第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-化学修饰 糖基修饰 是指将寡糖结构与蛋白质多肽分子中某些特殊功能团以共价键相连接。这种方法利用了天然的糖基化后翻译修饰过程，从而形成新的化学实体。糖基化修饰可以增加位阻、提高蛋白质水溶性和稳定性、减少肾小球滤过，从而影响蛋白多肽类药物的体内动力学特性、生物学活性、免疫原性和凝聚性等。第二节 蛋

17、白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-化学修饰 脂肪酸酰化修饰 是指将脂肪酸的羧基与多肽类的N-端残基上的氨基以酰胺键相连接。酰化也发生在半胱氨酸残基上，形成可逆性的酰化蛋白质。脂肪酸修饰可有效延长蛋白多肽类药物的体内半衰期，有助于提高药物的脂溶性、肠道黏膜透过性及吸收效率。第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-化学修饰 蛋白质融合 将高稳定性与高活性的蛋白分子与多肽类药物融合，可以有效地提高多肽类药物的稳定性和活性，融合蛋白类药物可通过融合基因的基因工程方式获得。氨基酸置换 如甘精胰岛素lantus第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-

18、化学修饰 贮库给药系统 是指在不改变蛋白多肽类药物化学结构的前提下延长其体内作用时间的制剂手段。贮库给药系统主要有：微粒给药系统、原位贮库（常为凝胶剂）、植入制剂和智能型给药系统等。蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-贮库给药系统 第二节 蛋白多肽类药物制剂 微粒给药系统 是近几年蛋白多肽类药物注射用缓释制剂的主要上市类型。它们可通过皮下或肌内注射后吸收入血获得全身作用，也可直接注射至身体的某特定部位实现局部治疗。另外，当微米和纳米颗粒的粒径范围适宜时，它们也可以直接静脉注射，以获得较长的循环时间。第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-贮库给药系统 原位贮库给药系统 通常为含

19、有生物可降解型载体材料和药物的黏性溶液或混悬液，药物可以溶解或混悬于该给药系统中。当皮下或肌内注射时，该黏性溶液或混悬液可通过不同的机制形成药物贮库，从而延长药物的释放以及作用时间。赛诺菲安万特公司上市的Eligard就是原位贮库给药系统的实例。第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-贮库给药系统 植入制剂给药系统 需要通过局部微创手术将无菌控释制剂植入患者体内。智能型给药系统 按生物信息自动调节药物释放量的给药系统。如胰岛素智能型给药系统是按照患者体内血糖浓度的高低自动调节胰岛素释放量，使血糖水平始终保持在正常范围的给药系统。第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注

20、射型新型制剂-贮库给药系统 蛋白多肽结晶或沉淀 除蛋白多肽化学修饰和贮库给药系统外，蛋白多肽结晶或沉淀也可以延缓蛋白多肽类药物注射后体内的溶出速度，以减少注射给药次数。例如：低精蛋白锌胰岛素就是一个含锌胰岛素与带正电荷鱼精蛋白结合的蛋白结晶混悬液，通过延缓体内的溶出速度而减少注射给药次数。第二节 蛋白多肽类药物制剂 蛋白多肽类药物的注射型新型制剂-结晶或沉淀口服给药 尽管蛋白多肽的口服给药是药剂领域最具挑战性的课题之一，但这种给药方式还是最具吸引力。由于蛋白多肽类药物分子量大、在胃肠道中稳定性差，使其口服生物利用度极低。要达到令人满意的效果，需要增加蛋白多肽类药物在小肠上皮细胞的透过性，降低蛋

21、白多肽在胃肠道中的降解以保持其生物活性。蛋白多肽类药物的非注射型新型制剂-口服第二节 蛋白多肽类药物制剂 肺部给药 肺部的独特生理学性质使其成为一个能够快速吸收蛋白多肽类药物的有效部位。但其长期用药安全性仍是业界担心的问题。如何提高肺部有效沉积量、提高药物肺部吸收是其肺部给药所需解决的关键问题。 蛋白多肽类药物的非注射型新型制剂-肺部第二节 蛋白多肽类药物制剂 经鼻给药 鼻上皮细胞表面覆盖着大量微绒毛，使鼻黏膜表面可用于药物吸收的面积大大增加。此外，鼻黏膜下含有丰富的毛细血管，使药物能够快速进入全身血液循环。已有一些蛋白多肽类药物经鼻制剂上市，如鲑降钙素、去氨加压素、布舍瑞林以及催产素的滴鼻剂

22、或鼻喷雾等。蛋白多肽类药物的非注射型新型制剂-经鼻第二节 蛋白多肽类药物制剂 经皮给药 经皮给药由于其具有使用方便，患者容易接受，可随时中断或者恢复治疗，可避免胃肠道刺激和肝脏首过效应等优点，近年来发展迅速。蛋白多肽类药物的非注射型新型制剂-经皮第二节 蛋白多肽类药物制剂 基因治疗 指将脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）等作为药物治疗疾病，是一种从基因层次干预疾病发生源头的全新治疗方法，具有巨大的应用潜力。广义的基因药物是通过磷酸二酯键连接起来的多核苷酸或寡核苷酸，以基因或基因表达通路为作用靶点，通过调节靶细胞中的基因表达，从而实现药物效应，包括各种cDNA表达系统、反义寡核苷酸、核酶

23、、小干扰RNA、微小RNA等。（一）蛋白寡核苷酸及基因类药物的结构和性质第三节 寡核苷酸及基因类药物制剂 物化性质：化学组成均为聚核苷酸结构，其中：DNA分子为脱氧核苷酸的聚合物；RNA分子为核苷酸的聚合物；此外还有硫代聚核苷酸的结构（其比RNA分子具有更好的稳定性）。体内稳定性：DNA和RNA分子容易被核酸酶降解，稳定性差。递送：由于基因药物的作用靶点都是在细胞内甚至细胞核内，除了少数局部给药外，基因药物的体内应用必须借助基因递送载体。（一）蛋白寡核苷酸及基因类药物的结构和性质第三节 寡核苷酸及基因类药物制剂 目前基因治疗领城主要有三类不同的药物递送技术体系，即：1）物理转染技术；2）病毒载

24、体系统；3）非病毒载体系统（二）蛋白寡核苷酸及基因类药物的递送载体设计第三节 寡核苷酸及基因类药物制剂 物理转染技术包括电脉冲导入、粒子轰击导入和超声介导基因转染等，主要是通过物理作用将DNA、RNA分子等导入细胞和组织中，一般局限于体表组织。非病毒载体系统：即采用高分子聚合物、脂质分子等一系列药用辅料制备成颗粒状的载体系统，装载DNA、RNA等活性分子，并将其递送到体内病灶或药物作用靶点部位。（二）蛋白寡核苷酸及基因类药物的递送载体设计第三节 寡核苷酸及基因类药物制剂 病毒载体系统包括反转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等，病毒载体的细胞转染率较高，但其体内应用受到病毒天然感染趋向性（tropis

25、m）的影响和人体免疫系统的干扰，造成静脉注射后转染的靶组织特异性不高，而且具有一定的安全隐患，如免疫应激反应、基因随机整合的致癌性和潜在内源性病毒重组等问题。（二）蛋白寡核苷酸及基因类药物的递送载体设计第三节 寡核苷酸及基因类药物制剂 疫苗（vaccines）由抗原组成，它可以激活免疫系统，产生抗体来对抗抗原，并诱导机体免疫记忆，使免疫系统在第二次遇到该病原体（抗原）时可以将其识别并破坏。因此，疫苗接种是对抗感染性疾病的一种预防性措施。可以说，疫苗是迄今为止临床治疗效率最高、治疗成本最低的公众健康防御手段。（一）概述第四节 疫苗制剂现有的人用疫苗可以分为三类：减毒活性病原体是传统的疫苗，这种疫苗是通过模拟自然条件下病原体对机体的感染过程，因此很有效；失活疫苗与减毒活性病原体疫苗相比，最大的优势是其安全性；亚单位疫苗与失活疫苗相比，的免疫炎症反应更少。还