lncrna芯片分析-自己总结

1、IncRNA芯片分析IncRNA芯片分析修改时间2010/6/16 13:57:12 点击3210次.归一化IncRNA芯片采用的归一化的方法为quantile normalization 。.差异LncRNA的筛选lncRNA芯片中既有lncRNA的探针又有mRNA勺探针，分别做差异基因的筛选，筛选方法同表达谱的筛选方法是一致的，参见 表达谱的差异基因筛选。.差异lncRNA的重注释lncRNA芯片注释不完善，因此需要将筛选出来的lncRNA进行重注释。将差异lncRNA在基因组上位置上下游延伸，以寻找lncRNA附近的有功能的基因。1prcbesct idstartendsIrandIra

2、n script,.i J1 runner t pt ion ID2rhrM心骷归63值加雌oaM*SV_1SJO4Schr71WW2I2010009014T17(M7279C7orf5l,173644TCI600249rhr 1621755878.TRltOISEOJC70A.Wl_OOHfil6S33TC020097Schr2加1巢3制201羽砧9TR02OtW-r(*SPATS2LZoauoori6TCI500678chrlo盹&33带4+TR 闺 115351BE21KP3Ml_O2447J差异IncRNA 重注释示例.差异IncRNA靶基因的预测IncRNA可能通过调控相应的 mRN

3、At挥功能，因此有必要预测IncRNA的靶基因。我们提取差异IncRNA和mRNA勺序歹U,首先用bIast进行初筛，之后用 RNApIex进行进一步筛选，以预测IncRNA可能调控的mRNALac KN*THrg*taEtAmHXA_BblDGena Hane BniretGem hRNA,.Length2ICQ100006 ehr!310023 HS25制LGH丽8 7735333吊001篇册3Cl Serf) 71M4米552533318 髓 7 HHs时】ICHM46四 U5八LS微龌侬L24017439；JCOlOOOW-chrl31OO2S-11492S1LG取！1 618s 71

4、9GAKI 25214MODS47382201SICOlOQOOfr-thrJ31OO2S-31 lS2i如LGWi：S2?933ie5l_01S29PNPO551633JS2CfC01Q0O06-clirl3 1(-314825布1】LGAFI】662a1043116埼7K01OKK)6chrl310025-314B2gillLGHs- 17 28913NOG翻魄IUX1709a4541931W25-31482IgnlXGM并网的EM州6翔蟆巴Fl3CL24gTCOlOOOOft-thr1 310023-314S23职】LJCH=S176J2970上管的酒口2FPI21326259g差异In

5、cRNA靶基因预测结果示例.差异IncRNA与靶基因共表达网络预测出IncRNA的靶基因后，并可进一步在 mRNA勺数据中探寻该 mRN麋否发生表达量的变化。由此构建差异IncRNA与靶基因相互作用网络图。出” 1D4 17E 匚 Gg CLScale Independencei 10 is 20Soft Threshold poeoOL s 0 0 59门足口岂55 即区区包0_&口L rlt* F力KGNAB2NPLlincRN?HMOX1CSI-2RAPLKNC1rLTRAPCXCL2.差异IncRNA靶基因的GO analysis对IncRNA的靶基因进行 GO Ontology的生物

6、学的分类，根据 Fishers Exact Test, 得到p-value ,得到IncRNA靶基因对应的显著性功能，从而了解lncRNA的功能。.差异 lncRNA 靶基因的 pathway analysis对lncRNA靶基因按照Pathway的主要公共数据库KEG&口 Biocarta来进行分类，对Pathway中的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著联系的Pathway分类，由这些pathway对应相应的靶基因，从而获得该分类即导致lncRNA差异的最重要Pathway o.差异lncRNA的转录因子的预测提取lncRNA TSS的上游2000bp,下游500bp,利

7、用HMM勺算法根据数据库预测其转录因子。芯片数据颈处理9差异表达IncRNAffiS 选IncRHA-mRNA共表达分析差异表达eRNA笳选装达模式聚类分析G。功能显著性富集分析IMRNA表达模式分析IncRNAtrans调控机制IncRNA-轧录因子二元关系及网络分析IncRMA功能预测IncRNAdS调控机制IncRK息-转录因子一把基因三元关系及网络分析Pathway 显著性富集分析蛋白互作网络分析常规分析内容ift级分析内容1）芯片数据预处理： 对实验数据质量评估，预处理及均一化处理。2）差异表达IncRNA及mRNA的筛选：根据客户提供样本量的大小与分布或实验目的，应用倍数法、 多重

8、假设检验等手段，对两条件或多条件下的表达差异的IncRNA和mRN粉别进行计算和筛选。派表达模式聚类分析：针对芯片结果进行本及差异表达IncRNA和mRNA勺聚类，寻找属于同一表达趋势的基因或样本。浓GO和pathway显著性富集分析：差异基因，应用数据库进行功能富集分析，挖掘具有统计学意义 的差异表达基因的功能类别。显著性 P值越小，则它随机聚集差异表达基因的概率越小，其功能相关性的 非随机性就越小，该功能模块有较大的可能与疾病（或药物作用）相关。蛋白互作网络分析：研究与指定蛋白质相互作用的其他蛋白质的信息，以使研究人员能够更加深入地认清相关蛋白质的功能，更清楚地理解其调控机制。IncRNA

9、-mRNA共表达分析：对于每一个差异表达的IncRNAs,计算得到与之共表达的编码基因。IncRNA表达模式分析： 考察差异表达 LncRNAs的表达模式，将 LncRNAs以及与该LncRNAs显著共 表达的编码基因的表达模式绘制heatmap oIncRNA功能预测：筛选出表达显著相关的IncRNA-mRNA关系对，利用成熟的 mRNA勺功能来推导 IncRNA的功能，对异常表达IncRNA显著相关的mRNA进行功能富集分析。IncRNA cis 作用机制研究： 对于感兴趣的差异表达IncRNAs,搜索其上下游100K范围内的所有编 码基因，并与该IncRNAs有显著共表达的基因取交集。这

10、些在基因组上临近、且表达模式上共表达的基因 很可能被该IncRNAs所调控。IncRNA trans作用机制研究：计算LncRNAs共表达的编码基因，集合与转录因子 /染色质调控复合 物的靶基因集合的交集，利用超几何分布计算该交集的富集程度，得到与 lncRNAs显著相关的转录因子， 从而识别可能与lncRNAs联合发挥调控作用的转录因子 /染色质调控因子。火lncRNA-转录因子二元关系及网络分析X lncRNA-转录因子-靶基因三元关系及网络分析综述长链非编码 RNA (lncRNA)来源：新药筛选中心/点击：1464lncRNA长链非编码RNA(long noncoding RNA ln

11、cRNA)是一类不编码蛋 白的RNA分子，长度在200bp以上，起初被认为是 RNA聚合酶II转 录的副产物，不具有生物学功能；近期的研究表明lncRNA具有保守的 二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程 的调控，尤其在肿瘤当中发挥了重要的调控角色，如染色质修饰、转 录激活和抑制、转录后调解以及作为miRNA的诱导分子干扰基因的表达等。随着高通量测序技术的发展，越来越多的 lncRNA被注释，但是 绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非 常广阔的未知领域，具有极大的研究价值和意义。IncRNA介绍长链非编码 RNA(long non-c

12、oding RNA , IncRNA)是一类转录本 长度超过200nt、不编码蛋白的RNA IncRNA起初被认为是基因组转录 的“噪音”，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明IncRNA能在表观遗传、转录及转录后水平上调控基因表达，参与了 X染色体沉 默、基因组印记以及染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等 多种重要的调控过程，与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联 系。为何细胞不惜耗费能量对这些非编码RNA的表达和定位进行严格调控呢这些RNA分析究竟有何功能 RNAM序技术的发展使人们得以初 窥这一神秘分子，现在IncRNA的许多相关信息都可以再新数据库中查 到，例如Broad研

13、究所、哈佛大学和麻省理工共同开发的 HumarBody Map lincRNAs catalog 。虽然近年来关于IncRNA的研究进展迅猛，但是现 在人们了解到的IncRNA只是冰山一角，绝大部分的IncRNA的功能仍 然是不清楚的。随着研究的推进，各类IncRNA的大量发现，IncRNA的 研究作为RNA研究的新领域，已经成为一个非常吸引人的方向，有待 广大科学家去探寻。IncRNA研究当前面临的一个主要挑战是，研究工具还在不断开发 和改进中，而IncRNA研究中非常关键的一步就是发现与特定疾病相关 的IncRNA。现阶段，基因芯片技术发展趋于成熟稳定，在此平台上， 通过设计不同检测Inc

14、RNA探针筛选IncRNA是一种准确快捷的方法。10IncRNA特征IncRNA通常较长，具有 mRN群结构，有些具有poly(A)尾巴，有 些没有poly(A)尾巴，分化过程中有动态的表达与不同的剪接方式， 与 编码基因相比，IncRNA表达量更低。派 组织特异性：不同组织之间的IncRNA表达量不同。次 时空特异性：同一组织或器官的不同生长阶段，其中的IncRNA表达量也会变化。X IncRNA启动子同样可以结合转录因子，如Oct3/4 ,Nanog,CREB Sp1, c-myc, Sox2与p53,局部染色质组蛋白同样具有特征性的修饰 方式与结构特征。冰 大多数的lncRNA在组织分化

15、发育过程中，都具有明显的时空 表达特异性，如有人针对小鼠的1300个lncRNA进行研究，发现在脑组织中的不同部位，lncRNA具有不同的表达模式。派在肿瘤与其他疾病中有特征性的表达方式。X lncRNA的亚细胞位置上也呈多样化， 在细胞核、细胞质和细胞 器均有分布，甚至某些lncRNA具有独特的亚细胞位置，有可能是全新 的亚细胞构成。11IncRNA功能IcmnlrfiFVKHrwiwniHkHia pfopcuinpIncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多种层面实现 对基因表达的调控：IncRNA通过招募染色质重塑复合物至特定的基因组位点使其发 生催化活性。如 HOTAIR2J

16、Xist、RepAF口 Kcnqotl 招募 Polycomb complex 至HoxD位点，使得X染色体或Kcnq1功能域的组蛋白H3第27位赖氨 酸发生3甲基化（me3K27,诱导异染色质形成，从而抑制该区域基因 表达。lncRNA通过多种机制进行转录水平调控。lncRNA结合到基因 cyclin D1 上，招募RNA吉合蛋白TLS来调控蛋白CBPffi p300的组蛋 白乙酰转移酶活性，进而抑制 cyclin D1转录。12c)超保守增强子转录出lncRNA-Evf2 ,该IncRNA能激活转录因子DLX2进而调控基因Dlx6转录。d) DHFR次要启动子区域转录出的IncRNA与该基

17、因主要启动子区 域结合形成三聚体，抑制转录因子 TFIID结合，从而使基因DHFRg生 沉默。e)反义lncRNA能够与剪接体(splicesome )中锌指同源 mRNAeb2 的5剪切位点结合，使内含子未被剪切掉，而该内含子序列中保留有 内部核糖体进入位点(IRE位点)，翻译过程中识别并结合该位点，导 致Zeb2基因表达和翻译。lncRNA分子机制随着lncRNA功能逐步显现，其与靶点的作用机制成为进一步的热 点。早期认为原位调控是LncRNA乍用的唯一机制，它通过招募形成染 色质修饰复合物而沉默邻近基因转录，例如IGF2R反义RNA(antisense of IGF2RRNAAIR)、X

18、IST等。而 Hox基因反义基因间 RNA(Hoxantisense intergenic RNA , HOTAIR讷发现提示LncRNA可能存在远程调控。同 源异型基因(homeotic genes , HOX在细胞增殖与定向分化中起关键作 用，人类Hox基因簇约含100个ncRN鹿因，其中HOTAI磔位于HOXC 基因座。HOTAIR的5端可招募结合多梳蛋白抑制复合物2(polycombrepressive complex2, PRC2借助 PRC2a个 H3K27甲基化酶 EZH2 SUZ12m EED使另一基因座HOXDt长约40kb的序列转录沉默，从而13在乳腺上皮细胞内使细胞内转录

19、倾向于胚胎成纤维细胞样表型。超过20%勺LncRNA能够通过结合PRC2或其他类似复合物发挥作用，提示LncRNA勺远程调控机制在生物体内广泛存在。其作用机制如下图所示，主要包括以下几种情况：4UCtuie till 叩gl I* MT |：ftiicinI ? Liimj.*r ciiiEKlciiiiit1凶幅ptmriTi m u,21山 111Hm ttrn.w Lnw lit h 学 u h siir ；.Spiicrnc：pfOCCiri1）在编码蛋白基因的上游启动子区（橘色）转录，从而干扰邻近蛋白编码基因（蓝色）的表达（如酵母 SER38因）；2）抑制RNA聚合酶n,或介导染色质

20、重构和组蛋白修饰，而影响 基因（蓝色）表达；IncRNA （紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰 mRNA勺剪切，进而产生不同的剪切形式；IncRNA紫色）与编码蛋白基因的转录本形成互补双链， 在Dicer 酶作用下产生内源性的siRNA,调控基因的表达水平；14IncRNA （绿色）结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性；作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位；可作为小分子 RNA（如 miRNA的前体分子。IncRNA芯片数据分析策略1）芯片数据预处理：对实验数据质量评估，预处理及均一化处理。2）差异表达IncRNA及mRNA勺筛选：根据

21、客户提供样本量的大小 与分布或实验目的，应用倍数法、多重假设检验等手段，对两条件或 多条件下的表达差异的IncRNA和mRN粉别进行计算和筛选。派表达模式聚类分析：针对芯片结果进行样本及差异表达 IncRNA 和mRNA勺聚类，寻找属于同一表达趋势的基因或样本。GO和pathway显著性富集分析：差异基因，应用数据库进行功 能富集分析，挖掘具有统计学意义的差异表达基因的功能类别。显著 性P值越小，则它随机聚集差异表达基因的概率越小，其功能相关性 的非随机性就越小，该功能模块有较大的可能与疾病（或药物作用）相 关。X蛋白互作网络分析：研究与指定蛋白质相互作用的其他蛋白质 的信息，以使研究人员能够更加深入地认清相关蛋白质的功能，更清 楚地理解其调控机制。lncRNA-mRNA共表达分析：对于每一个差异表达的lncRNAs,15计算得到与之共表达的编码基因Inc