JIANYANJISHU教学文案

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。JIANYANJISHU-免疫学检测即是根据抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未知的抗原。由于外源性和内源性抗原均可通过不同的抗原递呈途径诱导生物机体的免疫应答，在生物体内产生特异性和非特异性T细胞的克隆扩增，并分泌特异性的免疫球蛋白（抗体）。由于抗体抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定性、定位和定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。免疫学检测技术的用途非常广泛，它们可用于各种疾病的诊断、疗效评价及发病机制的研究。最初的免疫检测方法是将抗原或抗体的一方

2、或双方在某种介质中进行扩散，通过观察抗原抗体相遇时产生的沉淀反应，检测抗原或抗体，最终达到诊断的目的。这种扩散可以是蛋白的自然扩散，例如环状沉淀试验、单向免疫扩散试验、双向免疫扩散实验。单向免疫扩散试验就是在凝胶中混入抗体，制成含有抗体的凝胶板，而将抗原加入凝胶板预先打好的小孔内，让抗原从小孔向四周的凝胶自然扩散，当一定浓度的抗原和凝胶中的抗体相遇时便能形成免疫复合物，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正比。利用蛋白在不同酸碱度下带不同电荷的特性，可以利用人为的电场将抗原、抗体扩散，例如免疫电泳试验和双向免疫电泳。免疫电泳首先将抗原加入凝胶中电泳，将抗原各成分依次分散

3、开。然后沿电泳方向平行挖一直线形槽，于槽内加入含有针对各种抗原的混合抗体，让各抗原成分与相应抗体进行自然扩散，形成沉淀线。然后利用标准的抗原抗体沉淀线进行抗原蛋白（或抗体）的鉴别。上述的方法都是利用肉眼观察抗原抗体反应产生的沉淀，因此灵敏度有很大的局限。比浊法引入沉淀检测产生的免疫比浊法就是利用浊度计测量液体中抗原抗体反应产生的浊度，根据标准曲线来计算抗原（或抗体）的含量。该方法不但大大提高了检测的灵敏度，且可对抗原、抗体进行定量的检测。免疫印迹法则首先通过电泳分离标准的已知抗原，然后将电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，浸于待测血清中。如果血清中含有与一种或几种抗原相对应的抗体的话，则在该抗

4、原印迹部位形成免疫复合物沉淀。在洗去未结合的抗原和抗体后，在膜上加标记的抗人免疫球蛋白的抗体，此抗体可以和病毒抗原与人抗体形成的免疫复合物发生反应，最后加入显色底物（可以是普通显色剂，化学发光剂或放射性同位素等）进行显色。由于利用了第二种抗体进行了信号放大，并且可以利用高灵敏的显色方式，灵敏度也得到了很大的提高。目前该方法已经利用凝集反应检测抗原抗体反应也是较传统的手段之一。利用带有抗原的乳胶颗粒等不溶性的颗粒抗原与相应抗体结合形成凝集团块，通过凝集现象，就可以达到检测的目的。无论是直接凝集法还是间接凝集法都可对抗原或抗体进行检测。还可以利用二抗对信号进行放大，从而提高检测的灵敏度。利用补体介

5、导的反应（例如溶血反应），检测抗原抗体反应也是过去常用的方法。抗体与细胞表面抗原相遇，形成红细胞-抗体复合物即可使加入反应中的补体活化，导致细胞的溶解，此方法可用于红细胞的各种抗原或相应抗体的检测，此外利用补体反应的竞争效应，也可对抗原抗体反应进行定量的检测利用带有标记（荧光素、同位素、胶体金或酶）的抗体（抗原）检测抗原抗体反应是目前应用最广泛、最灵敏的方法，使用放射性同位素标记法可使检测的灵敏度达到pg级。由于带标记的抗体能准确而可靠地反映出抗原的位置和数量，且利用二抗可对信号进行放大，因此该方法可用于抗原定性、定量或定位检测。以下是几种常用的免疫学技术：1免疫荧光技术免疫荧光技术是利用荧光

6、素标记的抗体（或抗原）检测组织、细胞或血清中的相应抗原（或抗体）的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。根据荧光素标记的方式不同，可分为直标荧光抗体和间标荧光抗体。间标荧光抗体中一抗并不直接连接荧光素，而是先将一抗结合到蛋白，然后带有荧光素的二抗再结合至一抗。通过二抗的结合，能将信号进行放大，因此能在一定程度上提高检测的灵敏度，但是随之带来的高背景也降低了检测的特异性。近年来，随着荧光素和荧光检测技术的不断进步，荧光检测的灵敏度已经接近同位素检测的水平，直接标记的荧光抗体逐渐取代间接标记抗体。这些标记了荧光素的抗体直接结合至抗原，大大提高了检测

7、的特异性，使检测的结果更加准确可靠。荧光检测技术的发展，使得免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查IgM抗体，做为近期接触抗原的标志。利用单克隆荧光直接标记抗体鉴定淋巴细胞的亚类。通过流式细胞仪，针对细胞表面不同抗原，可以同时使用多种不同的荧光抗体，对同一细胞进行多标记染色。2放射免疫检测放射免疫检测技术是目前灵敏度最高的检测技术，利用放射性同素标记抗原（或抗体），与相应抗体（或抗原）结合后，通过测定抗原抗体结合物的放射性检测结果。放射性同位素具有pg级的灵敏度，且利用反复曝光的方法可对痕量物质进行定量检测。但放射性同位素对人体的损伤也限制了该方法的使用

8、。3酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶（AP）等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器，检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及BASELISA。间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内，然后依次加入一抗、标记了酶的二抗和底物显色，通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代。夹心法利用二种一抗对

9、目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异性。近年来，抗原的定量检测技术也不断推陈出新。近年来，在夹心法ELISA的基础上，开发了多抗原检测试剂盒，能同时检测微量液相样本中多个抗原含量。这项技术的应用大大缩短了诊断的时间，提高诊断的可靠性和及时性。4免疫金胶体技术胶体金技术经过30多年的发展到现在已日趋成熟，该方法是将二抗标记上胶体金颗粒，利用抗原抗体间的特异性反应，最终将胶体金标记的二抗吸附于渗滤膜上，此方法简单，快速，广泛应用于临床筛查。第一章项目的评估指标：金标准敏感性特异性预测值（阳性预测值阴性预测值）准确度受试者工作曲线方法学的评估指标：精密度准确度分析敏感度分析

10、范围分析干扰受试者工作曲线和医学决定价值常规工作中的质量监控指标：室内质控指标时间指控注意临床反馈意见第二章沉降系数：颗粒在单位力场中粒子的移动速度沉降速度：在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离普通低速离心机使用的注意事项1离心机移动后，最好4小时后再使用。庄子长期不使用，应取出。使用时在旋转轴上涂抹润滑油。2使用离心机应使用天平确定平衡离心管，离心管放入转子时应注意位置平衡对称，否则会损坏离心机。机器运行前检查转子盖，机器盖是否盖好.3使用离心机时不可超过离心机或转子的最高转速。4离心机使用完毕，应将离心机转头室及转子清理干净归位，以维持离心机及转子寿命及平衡。转自严禁带离本室。第三

11、章常用显微镜的种类：普通光学显微镜相差显微镜荧光显微镜倒置显微镜共聚焦显微镜电子显微镜普通光学显微镜的应用1打开光源开关2调节目镜的孔距3放置样本玻片4首先用低倍镜调焦及观察5调节屈光度6视场光栅调焦和跳中7孔径光栅大小8用毕的整理工作第五章电化学分析技术是利用被测离子浓度与电极电位之间的关系。对在零电流条件下电池的电动势进行测量，利用能斯特方程求的待测组分的活度或浓度。第六章电泳条件及其对电泳前迁移率的影响因素：电场强度溶液的PH溶液的离子浓度电渗焦耳热区带电泳(zoneelectrophoresis)：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。血清肌酸激酶同工酶原理时根据

12、ISO-CK分子结构的不同，在电泳缓冲液中所带电荷各异，可以从阴极到阳极将CK不同组分予以分离，其分别为CK-MMCK-MB和CK-BB。CK和CK-BB是用于证实急性心肌梗死的首选指标。等电聚焦电泳是一种利用具有PH梯度的电泳介质来分离等电点不同的蛋白质的技术。免疫印记法的基本原理：第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，相对分子质量越小，泳动速度越快。第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压100V和大电流12A，通电45MIN转移即可完成。第三阶段为酶免疫定位：将印有带白纸条带的硝酸纤维素

13、膜依次与特异性抗体结合和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。免疫印迹法在检验医学中的应用1在自身抗体检测中的应用包括抗核抗体抗双链DNA抗体可提取核抗原抗中性粒细胞之抗体抗磷脂抗体抗平滑肌抗体2在病原微生物中的应用病原微生物提取抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成萧条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便在实验室中供检测用，根据出现显色线条的位置可判断有无特异性抗原/抗体。免疫电泳的原理：利用区带电泳技术将不同电荷和相对分子质量的蛋白质抗原在琼脂分离开后，在与电泳方向平行的两侧开槽并加入抗血清。置于室温或37C使两者进行免疫扩散，个区带蛋白在相应位置

14、上与抗体反应形成弧形沉淀线。抗原含量越多，则反应沉淀线越接近抗体槽，形成较粗的沉淀弧线；反之，则形成的沉淀线较细。以此可作细微的蛋白质组分分析。在检验医学中的应用；1异常体液蛋白的识别根据各蛋白所处的电泳位置，可分为不同的区带2血清脂蛋白电泳血清镜琼脂糖凝胶电泳，再经染色后可出现不同脂蛋白的条带。第八章血气分析技术血气分析：是评价机体呼吸、氧化功能及血液酸碱平衡状态的必要指标。血气分析技术：是利用血气分析仪直接测定血标本中PH、Pa（O2）三项基本数据后，并按有关公式计算出其他参数指标的临床实验诊断技术。波尔效应：因酸碱度改变而影响Hb携带O2能力的现象。血气分析的主要参数：1、酸碱度2、二氧

15、化碳分压指血浆中物理溶解co2的压力。3、二氧化碳总量指存在于血浆中各种形式的co2的总和。代酸时明显下降，碱中毒时明显上升。4、氧分压指血浆中物理溶解o2的张力，是机体缺氧的敏感指标。5、氧饱和度指动脉血氧与血红蛋白的结合程度。参考值95%-98%6、血氧饱和度为50%时的氧分压指血红蛋白为50%氧饱和度时的氧分压。7、实际碳酸氢盐和标准碳酸氢盐AB指人体血浆中实际的HCO3-含量，是体内代谢性酸碱平衡的重要指标，也受呼吸因素改变的影响。SB指体温37Pa（CO2）5.32kpa（40mmhg）、O2Sat为100%时的HCO3-含量，排除了呼吸因素的影响。8、碱剩余指在标准条件下，即温度3

16、7C、一个标准大气压，Pa（CO2）5.32kpa（40mmhg），FO2Sat为100%时，用酸或碱将1L血液PH调整至7.40所需要加入的酸碱量。第九章酶免疫分析技术酶联免疫吸附试验ELAS基本原理时把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面，测定时，将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体发生反应形成抗原抗体复合物，结合到固相载体上的酶标抗原或抗体量与标本中待检抗体或抗原量成一定比例；经过洗涤去除反应夜中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化成有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物

17、质含量。1、双抗体夹心法检测大分子抗原基本原理利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇结合，形成固相抗体和酶标抗体的量相对于待检抗原时过量的，因此复合物的形成量与待检抗原的含量成正比。测定复合物中酶作用催化底物生成的有色物质量（OD值），即可去定待测抗原含量2、竞争法检测小分子半抗原小分子半抗原如地高辛，茶碱等药物以及T3T4和睾酮等激素因其只有一个抗原决定簇，只能用此法。基本原理待测样品中小分子半抗原和酶标小分子半抗原共同竞争结合固相载体上的特异性抗体，形成酶标的小分子抗原抗体复合物和非标记小分子抗原抗体复合物。待测样品中小分子半抗原含量越高，形成

18、的非标记小分子抗原抗体复合物就越多，而酶标的小分子抗原抗体复合物则越少。加入酶底物后，显色强度与待测样品中小分子抗原含量成反比关系。3、间接法检测抗体是测定抗体最常用的方法，属非竞争结合试验，基本原理将抗原预先连接到固相载体上，加入样品后，待检抗体与固相抗原结合形成固相抗原抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，以确定待检抗体含量。由于酶标二抗时针对一类免疫球蛋白分子，因此该法可用一种酶标二抗检测多种待检抗体，具有更好的通用性。4、双抗原夹心法检测抗体原理同双抗体夹心法测抗原

19、5、竞争抑制发检测抗体抗体的测定一般不使用竞争法，当抗原中杂质难以去除或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种模式测定抗体。如乙肝病毒核心抗体和乙肝肝炎病毒e抗体的测定，由于e抗原较核心抗原仅多29个氨基酸，e抗原很容易转变为核心抗原，因此其测定采用竞争法。该法需制备固相抗体、酶标记抗体及纯化的抗原，待测标本中无特异性抗体时，通过固相抗体-抗原-酶标抗体的反应顺序最后使底物显色。待测标本中有特异性抗体时，它和加入的抗原结合，使最终结合到固相上的酶标抗体减少，酶活性减少50%以上便使抑制试验阳性。可判定待测标本中是否存在特异性抗体。6、捕获法检测抗体捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清

20、中某种抗体成分的测定。基本原理先将针对IgM的第二抗体结合于固相载体，用以结合样品中所有IgM，洗涤出去等无关物质，然后加入特异抗原与待检结合，再加入抗原特异的酶标抗体，最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加入酶底物显色后，即可对样品中待检IgM是否存在及其含量进行测定。第十章放射免疫分析技术放射免疫分析技术是以放射性核素标记的抗原或抗体为参与免疫反应的失踪物，对待检物进行超微量分析的一类测定标本第十一章化学发光和荧光免疫技shu一.化学发光免疫分析技术的类型：1.化学发光免疫分析（CLIA）2.化学发光酶免疫分析（CLEIA）2.微粒子化学发光免疫分析（MLIA）4.时间分辨荧光

21、免疫分析法（TRFIA）/5.电化学发光免疫分析（ECL）.荧光偏振免疫分析（FPIA）二.电化学发光时对电极世家一定电压进行的电化学反应，反应的产物之间或体系中某种组分发生化学发光，用普通化学手段测量发光光谱及强度从而对物质进行痕量分析的一种方法。三.时间分辨荧光免疫分析法是将抗原抗体反应与荧光物质发光和时间相结合的荧光光谱技术。用3价烯土离子及其螯合剂作为示踪物，通过双功能基团的螯合剂与蛋白质多肽激素抗体核酸探针或生物活性细胞以共轭双键结合进行标记，待反应体系发生后，三价稀土离子螯合物可以在紫外线激发下，发出强度高持续时间长的荧光，利用延缓测量时间，待样品中蛋白质等背景荧光完全淬灭后，再测

22、量三价稀土离子螯合物的特异荧光，根据荧光强度和相对荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的第12章流式技术一.流式细胞术的概念：是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒逐个进行多参数定量分析的技术。二.主要技术指标：1.荧光测量灵敏度2.仪器分辨率3.前向角散射光检测灵敏度4.FCM的分析速度5.FCM的分选指标三.检测结果显示:1.单参数直方图2.二维点图3.二维高等图4.假三维图四.应用：（一）淋巴细胞亚群分析：1.与T淋巴细胞有关的CD分子：CD2.CD3.CD4.CD8.CD28;2.NK细胞标志：部分为CD2+.CD7+.CD56CD16与细胞毒效应

23、有关；3.活化T淋巴细胞标志：CD25.CD69.（二）其他方面应用：1.血小板功能方面的评价.2.细胞凋亡的检测.3.在器官移植和造血细胞移植中的应用五.血细胞分析仪的原理：1.电学检测原理（电阻抗原理）：血细胞与等渗的电解质溶液相比为相对的不良导体，其电阻值大于稀释溶液的电阻值；当血细胞通过检测器的孔径感受区时，检测器内外电极之间的恒流源电路的电阻值瞬间增大，产生电压脉冲信号；脉冲信号数等于通过的细胞数，脉冲信号幅度大小与细胞大小呈正比。应用：应用电阻抗原理可进行白细胞计数和分群、血小板计数、红细胞计数、红细胞平均体积和血小板平均体积测定及获得其他相关参数等。2.光学检测原理：六.流式细胞

24、术尿沉渣分析仪的工作原理。答：流式细胞术尿沉渣分析仪的测定是应用流式细胞术和电阻抗的原理进行的。当一个尿液标本被稀释并经染色液染色后，靠液压作用通过鞘液流动池。反应样品从样品喷嘴出口进入鞘液流动室时，被一种无粒子颗粒的鞘液包围，使每个细胞以单个纵列的形式通过流动池的中心(竖直)轴线，在这里每个尿液细胞被氩激光光束照射。每个细胞有不同程度的荧光强度、前向散射光强度和电阻抗的大小。仪器将这种荧光、散射光等光信号转变成电信号，并对各种信号进行分析，最后得到每个尿液标本产生出的直方图(histogram)和散射图(scattergram)。通过分析这些图形，即可区分每个细胞并得出有关细胞的形态七尿沉渣

25、采用自动化智能显微镜技术的仪器尿沉渣全自动分析仪基于影像流式细胞术来分析尿中油性成分。仪器能自动吸入未离心的尿液，经过粗滤网去除粘液等较大的颗粒，经甲紫燃料染色后进入平板式流动室内做层状流动，当尿液中颗粒通过自动化智能显微镜时，由高分辨率电视摄像机采取图像，由计算机数字化影像处理及重排，然后由检验人员根据内存中的各种细胞，管型及其他有型成分信息进行判断，然后将结果储存，计算，打印出来。根据图像容量中个有形成分的数量，计算出每微升尿内各种颗粒的数目。八尿沉渣检查是用显微镜对尿沉渣中的有形成分进行检查，识别尿液中各种细胞，管型，结晶，细菌，寄生虫和精子等有形成分，这些有形成分的鉴别鉴定。对肾脏和尿

26、路疾病的诊断和鉴别诊断病情严重程度和预后的判断都有重要的意义第13章染色技术一.细胞玻片的制作方法：取材-制片-固定-染色-镜检二.临床常用的染色方法：HE染色；瑞氏染色；吉姆萨染色；瑞氏-吉姆萨混合染色三.细胞化学染色定义：是指经化学处理使细胞的某一组份其化学变化，产生特殊的的染色反应，并通过显微镜来鉴定细胞中含有物的性质和位置的一类方法。四.细胞标本的取材和固定：1.细胞标本来源：血液、骨髓、穿刺液、脱落细胞、培养细胞、新鲜实体组织和石蜡包埋组织经处理后制备成的单细胞悬液。2.固定液选择标准：a、最好的保持细胞的形态b、最大限度的保存抗原的的免疫活性；分类：醛类固定液、丙酮及醇类固定液；固

27、定方法：浸入法、微波法；免疫细胞化学染色的细胞制片技术：a、细胞涂片、印片及细胞单层培养物切片.b超薄切片五固定的方法物理干燥高热和低温骤冷化学方法是用化学试剂配制成的固定液进行固定第15章自动生化分析仪一.全实验自动化TLA：是指借助实验室信息系统将临床实验中各类自动化分析仪器串联起来，组合成流水线作业的形式，把样品输送到不同的检测单元，并将这个仪器的检验结果合并输出，实现了远程的检验申请、实时在线检测、远程审核结果和实验数据的共享。二.分析方法：1.一点法.2.二点终点法（固定时间法）3.速率法：两点速率法、多点速率法、三.质量控制：人员培训、室内控制、室间质评四实验室自动化的特点是把各类

28、仪器集中起来形成一个核心，做到同一样品在不同检测原理的自动化仪器统一测定和报告，将自动化仪器与分析前处理分析后处理设备相连接成集成化。第16章基因分析技术PCR实际上是摸板DNA引物和4种DNTP存在的条件下，依赖与DNA聚合酶的酶促反映，类似于DNA的半保留复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物一.PCR原理：1.变性：模板DNA经加热至94c左右一定时间后.使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA离解，使之成为单链，以便与引物结合，为下轮反应做准备；2.退火：温度突然降至37-58c时，引物与变形的DNA单链模板在碱基互补的基础上形成引物-模板杂交双链。3.延伸：在60

29、-72c时，TaqDNA聚合酶使引物从5端向3端按照碱基互补配对原则沿着DNA单链模板进行延伸，随着4中dNTP的掺入，合成新的DNA互补链。二.PCR反应要素1.模板2.引物3.DNA聚合酶4.dNTP.5.PCR缓冲液三.PCR标准化：1.上岗人员培训2.标准化PCR诊断实验室：试剂准备区（10m2）-标本准备区(10m2)扩增区(6m2)产物分析区(15m2).3.PCR标准化操作程序:1.试剂配置.分装及保存2.标本的采集和处理3.基因扩增及其实验条件的选择4.扩增产物检测5.PCR结果的判读4.污染的预防和污染源的标准化处理:1.严格执行实验室的各项规章制度，按规程进行各项实验操作2

30、.实验时，必须戴一次性手套（处理标本时需戴乳胶手套），并随时更换。3、工作衣，手套及实验用器材应区分固定使用。4.不在PCR实验室从事分子克隆实验，不得在室内从事与实验无关的事宜。5.保持地面及桌面整洁，保持室内温度恒定，室内禁止使用电风扇。6.所有用于标本采集的试管，容器（应使用一次性实验物品）以及基因扩增管等模板或扩增产物污染的物品，应置于1mol/l盐酸中临时收集存放，以减少室内气溶胶形成。7.标本扩增后产物及一次性使用物品等实验材料，实验完毕密封包装（包装袋应有明显的生物污染标记），进行高压消毒并焚烧。8.对于不能进行高压消毒等方法处理的重复使用物品或器具，如塑料试管架等，可以用一般或专