TPA诱导K562细胞分化过程中线粒体铁蛋白表达情况研究

1、TPA诱导K562细胞分化历程中线粒体铁卵白表达环境研究孙蕾高举袁粒星陈婷婷潘玲丽周晨燕朱易萍【关键词】TPA；K562细胞；线粒体铁卵白；运铁卵白受体；铁卵白线粒体铁卵白(ithndrialferritin,tF)是2001年才创造的一种铁代谢相干分子，与胞浆铁卵白具有很高的同源性，也具有亚铁氧化酶活性和铁结合本领，但其表达范围于线粒体1。外洋开端研究表白，tF为线粒体内的铁存储卵白，tF的表达可使胞浆内铁向线粒体内转运，低落胞浆可变铁池labileirnpl，LIP程度，细胞呈缺铁状态，并通过铁调治卵白irnregulatryprtein,IRP和铁效应元件irnrespnsiveelee

2、nt,IRE的彼此作用在转录后程度上和谐调治运铁卵白受体1(transferrinreeptr1,TfR1)和铁卵白(ferritin,Fn)表达程度2。tF在细胞铁稳态调治方面大概具有非常紧张的作用。中国实行血液学杂志JExpHeatl2022;15(2)K562细胞诱导分化历程中线粒体铁卵白表达环境研究线粒体是细胞代谢最为茂盛的细胞器，是血红素和铁硫卵白合成的重要场合，也是活性氧自由基产生的紧张部位3,4。白血病细胞增殖代谢茂盛，对铁的需求大，但如今对白血病细胞线粒体铁代谢相识很少。为此，我们接纳TPA体外诱导K562白血病细胞定向分化动态研究了K562白血病细胞诱导分化历程中tF、TfR

3、1和胞浆FnRNA表达的变革环境，探究tF在白血病细胞线粒体铁代谢调治方面的作用，为创立针对铁代谢途径的白血病治疗新计谋奠基理论基矗质料和要领质料和仪器K562细胞造就K562细胞清醒后加RPI1640造就液含10FBS、100U/l青霉素和100g/l链霉素在37、5%2、饱和湿度孵箱中悬浮造就。实行分组用无血清RPI1640造就液将K562细胞悬液调解至浓度为5105/l，参加6孔板中，每孔接种量1106个细胞，置于37、5%2、饱和湿度孵箱中举行造就。实行组为TPA诱导分化造就组和比拟组，前者按照预实行效果，确定TPA终浓度为16nl/L，比拟组为K562细胞平凡造就。每孔共设3个复孔。

4、细胞形态不雅察网络各时点1、3、5天的实行组和比拟组K562细胞，用PBS洗涤2次，离心涂片后瑞氏染色，凉干后油镜下不雅察细胞形态，每片计数200个细胞，盘算诱导分化率。诱导分化率%=已分化细胞数/200100%细胞外貌D64表达的流式细胞术检测网络各时点1、3、5天的实行组和比拟组K562细胞，于四川大学华西病院肿瘤生物治疗中央检测细胞D64表达程度。PR扩增产物电泳和凝胶成像阐发统计阐发对相干资料用SPSS11.0统计软件别离举行统计学阐发。均数比力接纳t查验，率的比力接纳2查验。效果TPA诱导K562细胞分化的形态学不雅察瑞氏染色不雅察可见，比拟组K562细胞呈圆形或椭圆形，胞核大而圆，

5、胞浆少少，染色深蓝，94.5为未分化细胞，早幼阶段以下的细胞仅占5.5%。但TPA处置惩罚5天的K562细胞具有典范成熟单核细胞的形态特性，如体积增大，胞浆染色变淡，可见空泡样改变，核浆比例减小，核形态不规矩或呈肾形，核仁淘汰或消散，核染色质趋向致密。诱导分化率为95，与比拟组比拟有明显性差异P0.05，表白TPA可诱导K562细胞向单核细胞定向分化表1，图1。TPA诱导K562细胞分化历程中D64表达环境D64是成熟单核细胞紧张的外貌标记分子之一。我们接纳流式细胞术检测TPA诱导分化历程中，K562细胞外貌D64的表达程度。效果创造，TPA处置惩罚后第1天D64表达与比拟组比拟已有明显性差异

6、P0.05。随着诱导时间延伸，D64表达显着加强，而比拟组K562细胞D64表达无显着变革表2。诱导分化历程中铁代谢相干基因表达变革RNA表达上调。诱导分化第5天TfR1和FnRNA表达程度别离为诱导分化前的68.2%和1.97倍图2和表3-5。讨论铁到场细胞的能量代谢和血红卵白的生物合成等很多紧张的生理历程，为DNA生物合成和细胞保存、增殖所必须。同时铁可通过Fentn反响产生存性氧自由基，损伤生物大分子5。大量研究已经表白，细胞内铁稳态重要是通过胞浆内的IRP与铁代谢相干分子RNA上的IRE的彼此作用，在转录后程度上和谐调治细胞摄铁分子TfR1和储铁分子Fn的表达，精致调控胞浆LIP程度，

7、如许既可满意细胞种种代谢对铁的需求，又制止过多游离铁造成的细胞损伤6,7。线粒体是细胞电子转运和氧化复原反响最为活泼和茂盛的细胞器，是血红素和铁硫酸卵白合成的重要场合。在幼红细胞等细胞中，摄入胞浆中的铁绝大部门进入线粒体，到场血红素合成3。线粒体铁池必须与胞浆铁池处于动态平衡之中。但如今对两者间的铁动态互换及其调治机制的熟悉相称有限。外洋开端研究表白，tF大概在线粒体铁代谢调治方面发挥着紧张作用1，8。tF是新近创造的线粒体储铁卵白，基因定位于5q23.1，为单拷贝无内含子基因，RNA长度约1kb，编码区序列与胞浆铁卵白重链基因同源性高达80%。Levi等1研究表白，tF也具有亚铁氧化酶活性，

8、可将亚铁氧化为高铁，形成无毒性的氢氧化铁，储存在壳状布局的内腔中，防范氧化应激损伤，其摄取外源性亚铁的速率和本领与胞浆Fn相称，并且在去铁胺作用后，tF结合铁的本领乃至凌驾胞浆Fn8。按照tF卵白在线粒体的定位表达，体表里具有与胞浆铁卵白相称的摄铁本领及与铁结合的可逆性和可被动用性，我们以为，tF在白血病细胞铁代谢和细胞增殖方面大概发挥着紧张作用。因此，我们接纳TPA体外诱导K562白血病细胞定向分化，动态相识细胞诱导分化历程中tF表达程度的变革纪律，以及与细胞重要摄铁分子TfR1和胞浆储铁分子Fn表达变革间的彼此干系。我们接纳TPA作为诱导分化剂，研究了K562细胞在TPA诱导前后的形态学和

9、细胞表型的变革。效果表白，16nl/LTPA可诱导K562细胞向单核/巨噬细胞定向分化，不但出现出成熟单核/巨噬细胞的形态特性如胞浆染色变淡、核浆比例缩小等，并且代表髓系细胞的D64表达程度呈上升趋势，这与文献报道的同等11,12。尤为紧张的是，随着TPA诱导K562细胞分化，tFRNA表达程度举行性下调，诱导分化第5天表达程度仅为诱导分化前的50.3%。与此同时，TfR1RNA表达也渐渐低落，而FnRNA表达上调，诱导分化第5天TfR1和FnRNA表达程度别离为诱导分化前的68.2%和1.97倍。我们的研究效果，从相反方面证明了rsi和Nie两个研究小组的研究效果。rsi等8将tF转染至He

10、La细胞，效果创造HeLa细胞胞浆TfR1卵白表达明显上调，而胞浆Fn卵白表达明显下调，提示tF表达程度增高可导致细胞内铁的再漫衍，使胞浆LIP程度低落，细胞呈缺铁状态，利于细胞通过TfR1摄铁；而Nie等2通过转染，使H1299细胞株tF高表达，效果也证明tF高表达可导致细胞内铁从胞浆向线粒体转移，导致胞浆呈缺铁状态，表示为胞浆TfR1表达增高、胞浆Fn表达低落、胞浆IRP与IRE结协力加强、TfR1介导的铁摄取增长。按照以上研究效果，我们以为白血病细胞适度程度的tF表达，有利于胞浆LIP向线粒体转运，维持线粒体LIP处于一种适度较高程度，以满意白血病细胞线粒体中种种代谢对铁的需求；同时低落

11、胞浆LIP程度，使胞浆处于相对缺铁状态。细胞通过胞浆中的铁感到分子irnsensr如IRP感知细胞缺铁，从而上调TfR1表达，下调胞浆Fn表达，以利于白血病细胞通过TfR1摄取更多的铁，使白血病细胞具有比正常细胞更强的铁摄取本领。另一方面，白血病细胞同别的恶性肿瘤细胞一样，细胞的增殖周期并非处于同步化状态，因此要求线粒体中也存在某种不变的铁储藏。当细胞处于静止期时可以将游离性亚铁氧化成高铁状态而储藏起来，防范铁到场的氧化损伤，具有庇护作用。当细胞进入活泼的增殖期如G1和S期时能很快将铁开释出来满意细胞代谢所需。tF的布局和成效特点使它可以或许为线粒体内的种种代谢历程提供不变的铁储藏，使白血病细胞具有比正常细胞更强盛的铁储藏和使用上风。现实上正常幼红细胞中tF表达程度极低，但铁粒幼细胞血虚环状铁粒幼细胞中tF表达程度明显增高13。推测由于线粒体内血红素合成停滞，铁感到分子感知线粒体缺铁，导致胞浆铁转入线粒体，线粒体铁负荷举行性增长。但为防范线粒体铁积蓄所致的氧化应激损伤，tF表达代偿性上调，将过多的铁以无毒性的情势储存起来，这也提示tF具有庇护作用14。比来，Nie等15将tF高表达的H1299细胞株转入裸鼠，造成肿瘤动物模子。效果创造tF高表达裸鼠肿瘤生长速率和体积明显小于比拟组。透射电子显微镜不雅察创造，tF高表达的裸鼠