软坚消瘿汤对自身免疫性甲状腺炎大鼠细胞因子及凋亡蛋白Fas、Fasl表达的影响

1、软坚消瘿汤对自身免疫性甲状腺炎大鼠细胞因子及凋亡蛋白Fas、Fasl表达的影响【摘要】 目的 观察软坚消瘿汤对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠自身抗体、白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)和凋亡蛋白Fas、Fasl的影响,从细胞因子和凋亡蛋白关系角度探讨其作用机制。方法 SPF级SD雌性大鼠60只分为正常组、模型组,模型组运用甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合免疫注射法,联合饮用高碘水模拟大鼠EAT。造模完成后的大鼠分为中药组、雷公藤组、模型组。酶联免疫法检测甲状腺抗体、IL-1及TNF-水平,免疫组化染色法检测大鼠甲状腺细胞Fas、Fasl变化。结果 软坚消瘿汤能显著降低EA

2、T大鼠血清自身抗体、IL-1及TNF-水平,降低甲状腺细胞Fas、Fasl表达。结论 软坚消瘿汤通过降低EAT血清中自身抗体及细胞因子水平,致使凋亡相关蛋白Fas、Fasl表达下降,从而起到减轻甲状腺细胞凋亡作用。 【关键词】 软坚消瘿汤；自身免疫性甲状腺炎；细胞因子；凋亡蛋白；大鼠) Abstract：Objective To evaluate the therapeutic effect of Xiaoying Ruanjian Decoction on experimental autoimmune thyroiditis (EAT) from the levels of autoant

3、ibodies, interleukin-1, tumor necrosis factor- and apoptosis-regulated proteins Fas/Fasl of EAT rats, and investigate the mechanism from the relation between cytokines and apoptosis-regulated proteins. Methods Sixty SD female rats of SPF level were divided into normal group and model group. An anima

4、l model of EAT in rats was developed by injecting thyroglobulin mixed with Freunds adjuvant immunization and drinking periodate water. The rats modeled were divided into Chinese medicine group, western medicine group and model group. The levels of autoantibodies, interleukin-1, tumor necrosis factor

5、- were detected with enzyme-linked immunosorbent assay. The level change of Fas/Fasl in the thyroid of rat was observed with immunohistochemical staining. Results Ruanjian Xiaoying Decoction significantly reduced the levels of autoantibody, interleukin-1, tumor necrosis factor- and lowered the expre

6、ssion of Fas and Fasl in thyroid cells. Conclusion Ruanjian Xiaoying Decoction alleviates the levels of apoptosis-regulated proteins Fas/Fasl by decreasing the relative expression of antibodies and cytokines in serum levels, which plays a role in reducing apoptosis of thyroid cells. Key words：Ruanji

7、an Xiaoying decoction；experimental autoimmune thyroiditis；cytokine；apoptosis- regulated proteins；rat 细胞凋亡在自身免疫性甲状腺炎(AITD)病程中发挥重要作用,Fas及其配体Fasl结合后可引起滤泡上皮细胞凋亡发生。淋巴细胞及甲状腺细胞释放的细胞因子白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)介导了细胞凋亡。既往的研究表明,软坚消瘿汤在治疗AITD中疗效确切1。本实验旨在从细胞因子及细胞凋亡关联角度探讨其治疗AITD的机制。1 材料与方法1.1 动物 SPF级SD雌性大鼠,体重(11

8、010)g,46周龄,购于沈阳医学院实验动物中心,合格证号：SCXK(辽)2003-0016。1.2 主要仪器 酶标仪(奥地利),型号：Anthos 2010；37 电热恒温培养箱(上海博讯医疗设备公司),型号：HXP-9052MBE；离心机(法国Jouan),型号：C4-12；微量移液器(美国热电)；电子秤(上海精密仪器有限公司),型号：JY5022。1.3 主要药物及试剂 甲状腺球蛋白(TG)、弗氏佐剂(美国Sigma公司),甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、IL-1及TNF-等酶联免疫检测试剂盒(美国ADL公司),Fas抗体、Fasl抗体、SP试剂盒、DA

9、B试剂盒等免疫组化试剂盒(北京博奥森有限公司)。雷公藤多甙片：江苏美通制药有限公司产品,购于辽宁中医药大学附属医院药局,批号080601；软坚消瘿汤中药饮片(当归、柴胡、生牡蛎、海藻、昆布等)购于辽宁中医药大学附属医院中草药局。1.4 造模与分组 SPF级SD雌性大鼠60只,适应性喂养1周,按体重随机取15只为正常对照组,剩余为造模组。第2周起造模组饮用高碘水浓度为500 g/L2,对照组予蒸馏水。第4周起造模组于双后足皮下多点注射由完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化成油包水状的TG(TGCFA11),共2次,中间间隔2 d,每次每只含TG 100 g3,作为初次免疫。第5周于后背皮下多点注射由不

10、完全弗氏佐剂(IFA)乳化的TG,每次每只含100 g,每周1次,连续4周,作为加强免疫。第8周结束时成模。将成模后的大鼠随机分为模型组(13只)、西药组(13只)、中药组(14只)。1.5 给药 给药剂量按人和动物体表面积折算的等效剂量比值表计算出大鼠等效灌胃剂量。中药组予软坚消瘿汤,每只大鼠灌胃量为10 mL/(kgd),原药材含量为2.03 g/mL。西药组予雷公藤多甙片,研磨,温开水配成悬浊液(2.37 g/mL)等量灌胃。模型组及正常组灌服等量蒸馏水。各组均每日给药1次,连续6周。1.6 指标检测与方法1.6.1 抗体及细胞因子各组实验大鼠于治疗后第42日腹主动脉取血并处死,1 50

11、0 r/min离心获取血清,采用ELISA检测TGAb、TPOAb、IL-1及TNF-。1.6.2 凋亡蛋白处死大鼠,取双侧甲状腺,按试剂说明常规免疫组化制片,双盲显微镜观察凋亡蛋白Fas、FasL阳性表达位置,Mias99病理图像分析系统,定标为m,检测灰度值。1.7 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件,数据满足正态性和方差齐性,组间采用方差分析,所列数据采用xs表示。2 结果2.1 Fas、Fasl在甲状腺细胞上的表达 Fas、Fasl阳性表达主要定位于细胞膜及胞浆,均呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。正常组：无明显淋巴细胞浸润,未见浆细胞,滤泡上皮细胞表达少量Fas及Fasl,阳性率及着

12、色均较低。模型组：明显淋巴细胞及浆细胞浸润,浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞膜及胞浆内明显表达Fas及Fasl,其阳性率与着色程度均高,在远离淋巴细胞浸润的滤泡上皮细胞呈低表达,在浸润淋巴细胞上呈极低表达。西药组：较少淋巴细胞及浆细胞浸润,浸润淋巴细胞附近的甲状腺细胞的细胞膜及胞质内明显表达Fas及Fasl,其阳性率与着色程度较低。中药组：少量淋巴细胞滤泡上皮细胞浸润,未见浆细胞浸润,甲状腺滤泡上皮细胞的细胞膜及胞浆低表达Fas及Fasl,阳性率及着色均较低。2.2 各组大鼠血清抗体比较(见表1) 表1 各组大鼠血清抗体比较(略)2.3 各组大鼠血清IL-1、TNF-水平比较(见表2) 表

13、2 各组大鼠血清IL-1、TNF-水平比较(略)2.4 各组大鼠甲状腺组织Fas、Fasl灰度值比较(见表3) 表3 各组大鼠甲状腺组织Fas、Fasl灰度值比较(略）3 讨论 TPOAb、TGAb升高致使甲状腺细胞毒性增强,淋巴细胞浸润增多。淋巴细胞通过释放穿孔素激活凋亡系统致使凋亡加速,滤泡上皮细胞破坏。本实验结果显示,中药组及西药组双抗体均降低,中药组效果优于雷公藤组。故推论软坚消瘿汤通过降低抗体水平,减轻甲状腺淋巴细胞浸润,使淋巴细胞释放穿孔素降低,间接减少凋亡发生。EAT在细胞免疫参与下淋巴细胞释放大量细胞因子,其中IL-1、TNF-对滤泡上皮细胞破坏起重要作用,且这两种细胞因子与其

14、他因子构成复杂网路系统4,与甲状腺细胞凋亡关系密切。实验表明,IL-1诱导甲状腺TFC上B7.1分子的表达,刺激T细胞的活化,加速了滤泡上皮细胞与T细胞的结合,导致了滤泡上皮细胞的破坏5。EAT为细胞免疫和体液免疫共同参与的滤泡破坏和抗体产生过程。血清中高滴度的细胞因子成为疾病发生直接原因。本实验结果显示,中药组及西药组均可降低血清IL-1、TNF-水平,但软坚消瘿汤疗效优于雷公藤组,推测软坚消瘿汤降低血清IL-1、TNF-水平起到了重要作用。 细胞凋亡为细胞在生理或病理状态下有序死亡过程。Fas系统在调控凋亡中起到重要作用。Fas在人体多数组织中均有表达,配体Fasl在天然滤泡细胞亦有存在,

15、Fas与Fasl相遇即造成细胞凋亡。EAT释放大量细胞因子导致Fas的高表达与细胞表面的Fasl配体结合致使细胞凋亡增多。本实验显示,模型组甲状腺细胞Fas、Fasl在淋巴细胞浸润区高表达,治疗组呈低表达,故中药组及西药组均能降低甲状腺细胞中Fas、Fasl水平,但中药组优于西药组。由此推测,软坚消瘿汤可能通过显著降低甲状腺组织中Fas、Fasl水平而抑制了甲状腺滤泡上皮细胞凋亡的发生。 实验显示,甲状腺组织中淋巴细胞Fas与Fasl表达较少,相反滤泡细胞呈现高表达,推测淋巴细胞对甲状腺细胞的杀伤原因并非是其分泌的高水平Fas与Fasl,而可能是其分泌大量的细胞因子刺激滤泡细胞高表达Fas、F

16、asl,导致凋亡发生。研究表明,IL-1诱导正常甲状腺细胞Fas、Fasl凋亡。甲状腺细胞在IL-1作用下能检测G1峰前明显“凋亡”峰,未经IL-1的作用,此峰不明显6,本实验结果符合以上结论。软坚消瘿汤降低血清中IL-1、TNF-浓度,同时甲状腺组织中Fas、 Fasl表达亦明显下降。可以推测,软坚消瘿汤治疗EAT机理在于通过降低淋巴细胞IL-1、TNF-的表达,间接使甲状腺组织中Fas、FasL表达降低,从而起到抑制甲状腺细胞凋亡的作用。【参考文献】 1 程 淼,张 兰.软坚消瘿汤对EAT小鼠血清甲状腺抗体和甲状腺功能影响的实验研究J.光明中医,2008,23(8)：1085.2 石 佩,崔玉玲.高碘和甲状腺球蛋白诱发实验性自身免疫性甲状腺炎的研究J.长治医学院学报,2006