第1部分蛋白质的结构与功能教学知识

1、第1部分蛋白质的结构与功能教学知识生物体内的蛋白质含量 除水以外，机体组织中最多的是蛋白质，占人体干重的45%蛋白质功能十分复杂，机体任何功能均与蛋白质有直接关系，大体可以分为：结构，运动，运输，防御，催化，信息等。第一节 蛋白质的分子组成元素：C、H、O、N、S，特点是含N 13-19% ， 平均16%蛋白质中氮的含量比较恒定，平均为16%，故可以用定氮法测量蛋白质含量每克氮相当于6.25克蛋白质一 氨基酸 Amino Acid自然界组成蛋白质的氨基酸有20种，都属于L-氨基酸（D系氨基酸也有，构成自然界小分子，而不构成蛋白质大分子）通式为 也可写为HaOHCRNHO2CHaOCRNHOC3

2、+_氨基酸 Amino Acid 2氨基(NH2-)和羧基(-COOH)同共连于 -碳原子上。其中19种为L-氨基酸(除甘氨酸外)，另外，脯氨基酸为亚氨基酸，不过一般统称氨基酸由于组成蛋白质的氨基酸是不完整的，所以称为氨酸酸残基（一）氨基酸的分类 20种氨基酸，依其R侧链可以分为以下4种：非极性疏水性氨基酸 （7种）：侧链为烃基或氢 甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸极性中性氨酸酸 （8种）：侧链含有杂环、羟基、酰胺基、巯基等 色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸氨基酸的分类 2酸性氨酸（2种）：侧链含有羧基 天冬氨酸、谷氨酸碱性氨基酸（

3、3种）：侧链含有氨基、胍基或咪唑基 赖氨酸、精氨酸、组氨酸在蛋白质中，脯氨酸可被修饰为羟脯氨酸、两个半胱氨酸的巯基可脱氢形成二硫键，称为胱氨酸（二）氨基酸的理化性质1 两性电离与等电点氨基酸的氨基和羧基具有一定碱性和酸性，在酸性环境下，氨基可以接受H+生成+H3N-，在碱性环境下，羧基可以游离H+ 生成-COO-，因此氨基酸是两性电解质。在某一pH的溶液中，氨基酸离解成阳离子和阴离子的趋势相等，成为兼性离子，对外呈电中性，此时该溶液的pH值称为此氨基酸的等电点pI氨基酸的理化性质 22 紫外吸收性质: 色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm波长附近，由于大多数蛋白质都含有此二种氨基酸，所以可以

4、利用此性质快速测定蛋白质。3 茚三酮反应: 氨基酸与茚三酮水合物共热，茚三酮水合被还原，后者再与氨基酸分解出的氨反应，生成蓝色化合物，可在570nm波长处测定，用于氨基酸的定量二、 肽 peptide(一) 肽(peptide)1 肽键：一个氨基酸的-COOH 和另一个氨基酸的-NH2脱水形成肽键，化学上一般称为酰胺键(p10)2 氨基酸之间借肽键连接起来叫肽，由两个氨基酸残基组成的肽称二肽，由三个氨基酸残基组成的肽称三肽， 肽 （peptide）由多个氨基酸残基组成的肽叫多肽蛋白质是由多个氨基酸残基组成的肽，因此，称为多肽，有时也称多肽链寡肽：氨基酸残基数不大于10的肽链。（一）生物活性肽人

5、体内有许多具有特殊作用的肽，在神经传导、代谢调节、保护机体功能等方面有重要作用，统称为活性肽，常见的有：1 谷胱甘肽（GSH） 是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸组成的三肽。其结构上的特点是：第一个肽键由谷氨酸的羧基与半胱氨酸的氨基组成生物活性肽 2生理活性：谷胱甘肽分子中半胱氨酸上的巯基具有还原性，是体内重要的还原剂，保护体内蛋白质、酶分子中的巯基不被氧化；在谷胱甘肽过氧化物酶的催化下，GSH还原细胞内产生的H2O2；阻断外源嗜电子毒物，保护DNA、RNA。 生物活性肽 32 多肽类激素及神经肽激素肽类：多为促激素类 如催产素（9肽）、加压素（9肽）促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（

6、焦谷氨酰组氨酰脯氨酸 3肽）神经肽：有信号转导作用 如脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）、P物质（10肽）、神经肽Y等三 蛋白质的分类1 依分子形状分：球状蛋白质和纤维状蛋白质球状蛋白质，形状为球形或椭圆形，多数可溶于水，如酶、转运蛋白、抗体等纤维状蛋白质，分子长轴比短轴长10倍以上，多为结构蛋白质，较难溶于水，作为细胞的支架蛋白质的分类2 依组成分：单纯蛋白质和结合蛋白质单纯蛋白质，只由氨基酸残基组成，即只由肽链组成。结合蛋白质，蛋白质部分+非蛋白质部分，蛋白质部分为肽链，非蛋白质分部称为辅基。辅基是蛋白质功能不可或缺的重要组分。常见的有色素、寡糖、脂类、磷酸、金属离子，核

7、酸等第二节 蛋白质的分子结构体内有生理活性的蛋白质有着特定的结构，这种特定结构的改变，就会使其活性受到影响，甚至失去活性。这种特定结构包含两方面的意义： 1 组成肽链的氨基酸的种类和顺序； 2 肽链中各残基及其侧链在空间的相对位置。前者称为蛋白质的一级结构，后者称为蛋白质的空间结构，空间结构包括二、三、四级结构一 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构是指在多肽链中氨基酸残基的排列顺序，以及它们之间的连接方式化学键：共价键连接 主键是肽键，其次是二硫键 蛋白质的一级结构肽链一级结构的写法有一定要求： N端或称氨基末端位于左侧，C端或称羧基末端位于右侧，氨基酸残基的顺序从左到右顺序排列一级结构是蛋白质

8、空间构象和特异生物学功能的基础，但一级结构并不是决定蛋白质空间构象的唯一因素二 蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中某一肽段肽链的局部空间结构，也就是该肽段主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象空间结构的研究方法 ：X射线晶体衍射法（X-ray diffraction）蛋白质的二级结构 参与肽键的6个原子组成的平面叫肽单元包括： C1，C，O，N，H，C2肽单元（peptide unit） 特征： 1 参与肽键的6个原子位于同一平面 2 肽键有部分双键性质不能自由旋转 3 C1与C2为反式结构，其上连接的两个单键可自由旋转蛋白质二级结构 二级结构的形式：-螺旋（-Helix）-折

9、叠（ -pleated sheets）-转角（ -bend orturn）无规卷曲（random coil)-螺旋（-Helix）蛋白质分子肽链中的某些段落，可以沿着其的长轴，以右手螺旋方式进行反复、规律、周期性的排列。-角蛋白中肽链螺旋结构就是这样，故称为-螺旋特点：1右手螺旋 2每3.6个氨基酸上升一圈 3螺距为0.54nm 4肽键的N-H与第4个肽键的羰基氧形成氢键，氢键与螺旋长轴基本平行-折叠（ -pleated sheets）肽链沿长轴充分伸展，整个肽链形成一个锯齿状结构，几条肽链彼此平行，靠H键维系固定，就形成了片层结构特点：折纸状，平行或反平行排列 -转角（ -bend ortu

10、rn）在球状蛋白质分子中，肽链常常会出现180o回折，回折部分即成为-转角特点：4残基组成，第一个残基的羰基氧与第四个残基的氨基氢形成氢键，第二个残基常为脯氨酸无规卷曲（random coil) 无确定规律的肽链结构模体与分子伴侣模序：蛋白质分子二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互靠近，形成具有特殊功能的空间结构被称为模序（motif）。有三种形式： -螺旋组合（ ）、 -折叠组合（ ）、-螺旋-折叠组合（ ）。不同模序有不同的结构和功能，P15分子伴侣（chaperon）：一类蛋白质分子，可逆地与未折叠肽链的疏水部分结合，诱导其正确折叠和形成特有二硫键 。三 蛋白质的三级结构指整条肽链

11、中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置三级结构的维持：疏水作用，离子键，氢键，范氏力等蛋白质的三级结构 域结构在较大的蛋白质分子中，常可分割成折叠得较为紧密,在空间上可以明显区别的1个或数个球状或纤维状区域结构域各有相对独立的功能。如纤连蛋白三级结构形成后，生物学活性必需基团靠近，形成活性中心或部位，即蛋白质分子表面形成了某些发挥生物学功能的特定区域。四、蛋白质的四级结构二个或二个以上具有独立的三级结构的多肽链，彼此借次级键相连，成为一定的空间结构，称为四级结构具有独立三级结构的多肽链，称为亚基或亚单位（subunit），亚基可以相同，亦可以不同单独亚基，多

12、无生物学功能，二个以上亚基聚合成为有完整四级结构的蛋白质，才有功能，如血红蛋白第三节 蛋白质结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系(一)级结构是空间构象的基础 Rnase是由124氨基酸残基组成的单肽链，分子中 8 个Cys的-SH构成4对二硫键，形成具有一定空间构象的蛋白质。（二）一级结构与功能的关系一级结构相近，空间结构相近，功能相近蛋白质一级结构的种属差异与分子进化对于不同种属来源的同种蛋白质进行一级结构测定和比较，发现存在种属差异，这种差异可能是分子进化的结果但与活性和蛋白质空间结构密切相关的氨基酸残基高度保守。蛋白质的一级结构与分子病 现知几乎所有遗传病都于蛋白质分子结构改变

13、有关，都称之为分子病。 镰刀型红细胞贫血是1944年首先被发现并称为分子病的。二、蛋白质的空间结构与功能的关系Hb结合氧：第一个O2结合时，要打开的盐键不只是4个亚基间盐键的1/4，而是要多一些，打开盐键需要能量。因此，第一个O2的结合需要的能量多于第2、第3个O2 结合到第4个O2时，需能更少，带O2速度比第1个时大几百倍。Hb与O2后Hb的构象变化，这类变化称为变构效应，即通过构象变化影响蛋白质的功能Hb称为变构蛋白（allosteric protein）蛋白质的空间结构与功能的关系构型（configuration）：L、D，改变时有共价键的断裂构象（conformation）：改变无须有

14、共价键的断裂，只是次级键断裂一级结构是蛋白质生物学功能的基础，空间结构与功能的表现有关第四节 蛋白质的理化性质及其分离纯化等电点（ PHPI） （Isoelectric Piont）等电点的计算R为非极性基团（ R为非游离基团） PI=1/2（PK-COOH/PK1+PK-NH2/PK2）R为极性基团 酸性氨基酸：PI=1/2（PK-COOH+ PKR） 碱性氨基酸：PI=1/2（ PK-NH2 +PKR）Cys 按酸性氨基酸；Tyr 按R为非极性基团情况计算（二）蛋白质的胶体性质胶体溶液：溶质颗粒直径在1-100nm的稳定溶液 易沉降 粘度大 不能透过半透膜蛋白质胶体溶液的稳定因素： 水化膜

15、 带电荷（三）蛋白质的沉淀作用使蛋白质从溶液中析出的现象称为沉淀，方法有：盐析（salting out）有机溶剂沉淀重金属盐沉淀 条件：pH 稍大于pI为宜生物碱试剂与某些酚类沉淀蛋白质 条件：pH稍小于pI （四）蛋白质的变性作用、结絮和凝固在某些理化因素作用下，蛋白质严密的空间构象破坏，导致若干理化性质和生物学性质的改变变性因素：1）物理因素：高温、高压、射线等2）化学因素：强酸、强碱、重金属盐、某些有机溶剂等变性的表现和意义变性后的表现：1）生物学活性消失2）理化性质改变 如粘度增大，易沉淀，结晶能力丧失等变性的意义：1）消毒、灭菌；防止变性有利于蛋白质的保存2）变性后易消化（五）蛋白质

16、的颜色反应蛋白质的颜色反应主要与蛋白质的定性、定量测定有关：茚三酮反应双缩脲反应酚试剂反应（六）蛋白质的紫外吸收特征蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外线，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其对紫外光吸收能力的强弱顺序为：色（Trp）酪（Tyr）苯丙可利用此性质对蛋白质溶液进行快速测定，其特点是不破坏样品。二 蛋白质的分离与纯化（一）丙酮沉淀及盐析丙酮沉淀：0-4，加10倍体积的丙酮，另外也可用乙醇沉淀盐析（salt precipitation）：是将硫酸铵、硫酸钠、或氯化钠等中性盐加入蛋白质溶液，不同蛋白质可在不同盐浓度和一定pH时产生沉淀，此法可用于蛋白质的初步分离（二）电泳电泳的概念：带电离子受

17、电场作用发生位移的现象原理：蛋白质分子在低于或高于其pI的溶液中带有电荷，在电场中可向其电荷相反的电极移动，用此法可分析和分离蛋白质电泳的载体：纸、薄膜等（三）透析（dialysis）用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。透析袋是具有超小微孔的膜，不同的膜有不同的孔径。微孔一般只允许10000以下的化合物通过（四）层析（chromatography）层析种类：蛋白质分离纯化中常用的有离子交换层析，亲和层析，肽段的分离纯化中也有用双向纸层析（五）分子筛（gel filtration）：也称凝胶过滤。柱填料多用葡聚糖分子筛 用于分离的材料是充满孔径的凝胶颗粒，小的分子可进入孔径内大分子无

18、法进入，在洗脱过程中，大分子先流出，小分子由于路程较长而后流出，从而使蛋白质得以分离（六）超速离心（ultracentrifugation）蛋白质在高达50万g 的重力作用下，在溶液中逐渐沉降，直到其浮力（buoyant force）与离心力所产生的力相等，此时蛋白质不再沉降，不同密度蛋白质的密度与形状不同，此时在离心管不同位置可形成不同的蛋白质沉降带，收集不同带的成分，可达到分离纯化蛋白质的目的。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数S表示三 多肽链中氨基酸序列分析1、 氨基酸组成分析用于序列分析蛋白质，需是均一的，已知大概分子量，然后将此很纯的蛋白质样品彻底水解标准水解法：用6N HCl，于100-120下，在真空瓶中进行。水解时间为10-24 hr。水解后去除过量的HCl，