遗传重组-转座-敲除(2)ppt课件

1、第九章 DNA的重组与转座重组的定义遗传重组的类型同源重组的分子机制重组和酶位点特异性重组转座转座的机制遗传重组的运用6.0 重组DNA分子的断裂和重新衔接导致遗传信息的重新组合，称为重组recombination。重组的产物称为重组DNArecombinant DNA，一切的DNA都是重组DNA。由于重组，一个DNA分子的遗传信息可以和另一个DNA分子的遗传信息结合在一同，也可以改动一条DNA分子上遗传信息的陈列方式。DNA重组广泛存在于各类生物中，阐明重组对物种生存具有重要意义。经过重组实现基因的重新组合使物种可以更快地顺应环境，加快进化的过程。此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程，

2、比如重组在DNA损伤修复和突变中发扬重要作用。6.1 遗传重组的类型 根据对DNA序列和所需蛋白因子的要求，可有三种类型的重组。其共同点是这些过程都涉及双链DNA之间的物质交换，但其发生的情况有所不同。遗传重组的三种类型1同源重组 它的发生是依赖大范围的DNA同源序列的联会。在重组过程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。需求重组的蛋白质参与，eg.大肠杆菌中的RecA蛋白、RecBCD蛋白；蛋白质因子对DNA碱基序列的特异性要求不高；存在重组热点和序列长度的影响真核生物染色质的形状影响重组的频率。特点：同源重组能够发生在两条同源的DNA的恣意位点(3)异常重组 完全不依赖于序列间的同源性

3、而使一段DNA序列插入另一段中，但在构成重组分子时往往是依赖于DNA复制而完成重组过程。eg.转座作用，需求转座酶和对转座区域DNA的复制。(2)位点专注性重组 重组依赖于小范围同源序列的联会，发生准确的断裂、衔接，DNA分子并不对等交换 eg. -phage DNA对E.coli 的整合(attPattB)，需求有15 bp的同源序列和专注性的蛋白质因子参与。 位点专注重组发生在两条特定的序列，两条重组DNA的其他序列那么是不同的。位点专注重组能使二聚体环状DNA分子产生两个单体环状DNA分子6.2 同源重组的分子机制同源重组homologous recombination发生在两个同源DN

4、A分子之间。真核细胞减数分裂过程中，同源染色体彼此配对，同源染色体DNA片段发生交叉与互换。Darlington D. C.于1936年提出：减数分裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重接，以消除张力，从而产生重组。6.2.1 断裂与重接模型First Meiotic Interphase (cells contain 4N DNA content) Bivalent sister chromatidsalign with each other, thisact is termed synapsis.Synapsed sister chromati

5、dsare termed a synaptonemal complex) Figure 5-55, page 185两条同源DNA分子彼此并排对齐，相互配对DNA中两个方向一样的单链在DNA内切酶的作用下,在一样位置上同时切开。在切口处发生链的交换，构成所谓的衔接分子joint molecule，也称Holliday构造Holliday structure。分支点可以发生挪动，称为分支迁移branch migration，分支迁移的结果是在两个DNA分子中构成异源双链区heteroduplex。1. Holliday modelSynapsedchromatidsRecombinationjo

6、intHeteroduplex DNA 链交换所构成的衔接分子必需进展拆分，才干构成两个独立的双链分子。这需求再产生两个切口。反响结果要看切开的是哪一对链，假设切口发生在当初未切的两条链上，那么原来的4个链就全被切开，就会释放出剪接重组DNA(splice recombinant DNA)分子。ABBAABABABBAHolliday intermediatesABBAA BA BA BA BEndonucleasesaka. resolvases(e.g. RuvC)Products beforeDNA repairHolliday Intermediate(see Photo inLehn

7、inger pg 962) 假设切口发生在当初被切的两条链上，衔接分子拆分后将构成补丁重组体patch recombinant。分开的两个DNA分子除保管了一段异源双链DNA 外，均完好无缺。因此，衔接DNA分子无论如何拆分，所构成的两个独立的DNA分子总有一段异源双链区，但是异源双链区两侧的重组未必同时发生。Termed “patch recombinants两条双链体DNA分子间的重组关键是单链的交换。当双链体DNA的单链与相对应的另一双链体中的单链发生置换时，会产生一个分叉构造。交换产生异源双链体DNA片断，两条单链分别来自父本和母本。结合分子可以经过切开相接的链从而构成两条分开的双链体

8、分子。DNA双链体配对同源链被切出缺口在双链体之间，断裂链交换靠分叉迁移，使交叉点挪动在双链体间第二链交叉，切口被封锁两条配对双链体DNA的重组包括相互的单链交换、分叉交换和缺口的切出。Holliday模型Holliday R.于1964年提出旋转显示Holliday接头构造 切口控制结果根据链被切出缺口的位置, Holliday构造的结果可产生亲本双链体或重组双链体.两种类型的产物都有一段异源双链体DNA. Holliday模型可以较好解释同源重组景象，但也存在问题。该模型以为进展重组的两个DNA分子在开场时需求在对应链一样位置上发生断裂。DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难想象两个分子

9、何以能在同一位置发生断裂。6.2.3 Meselson-Radding模型 Holliday模型中为对称的杂合双链，而实践情况有不均等分别景象。1975年，Matthew Meselson 和 Charles Radding对Holliday 模型进展了修正。 Holliday模型要求在两个并排对齐的同源DNA分子的对应位点构成单链切口，从而产生游离的单链末端。然而，在Meselson-Radding遗传重组模型中，仅在一个双螺旋上产生单链切口。利用切口处3-OH合成的新链把原有的链逐渐置换出来，使之成为以5P为末端的单链区。随后游离的DNA单链侵入另一条DNA双螺旋中，取代它的同源单链并与其

10、互补链配对构成异源双链区，被置换的单链构成D环D-loop。D环单链区随后被切除,两个DNA分子在DNA衔接酶的作用下构成Holliday交叉。与Holliday不同，此时只在一条DNA分子上出现异源双链区。假设发生分支迁移，在两条双螺旋上均出现异源双链区。随后发生的衔接分子的拆解与Holliday模型一样。但是更多的现实阐明，重组是由双链断裂所启动。如今以为，同源重组是减数分裂的缘由，而不是减数分裂的结果。DNA分子双链断裂才干与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去。因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。6.2.4 双链断裂重组模型model of double-st

11、rand breaks recombination 一条染色体的两条链都发生了断裂，断裂是由内切酶水解磷酸二酯键的结果。DNA断裂之后由核酸外切酶扩展缺口, 接着是断裂链的游离3端插入到具有完好双链的同源染色体中，构成D-环构造。在DNA聚合酶的作用下，断裂两条链分别以完好链为模板开场所成, 最后再经过断裂重接过程完成重组。在受体中构成双链断裂断裂扩展为含有3端的间隙3端转到其他的双链体上3端的合成交换了间隙的一条链置换的链迁移到其他双链体上DNA的合成发生于其他3端间隙被供体序列替代相互挪动产生了双交换6.3 重组和酶在原核生物同源重组中存在8个碱基组成的Chi位点重组热点 5 GCTGGT

12、GG 3 3 CGACCACC 5 在E.coli中每隔约510 kb有一个拷贝Rec和Ruv蛋白参与重组。RecA蛋白RecA具有单链DNA和双链DNA的结合活性，能启动DNA单链和与之互补的双链分子进展碱基配对催化单链取代。 RecA能促进SOS反响中的蛋白酶活性。 单链取代 (single-strand uptake)其中一个DNA 分子要有单链区；其中一个DNA 分子要有游离的3末端；单链区和3末端可和另一DNA分子互补。 RecA具有的处置DNA活性使一条单链能与一条双链体中的同源部分发生置换，这个反响称为单链同化。这个置换反响可发生在几种不同构型的DNA分子之间，但要具备3个条件：

13、在双链体与单链分子之间RecA催化链交换只需其中的一条反响链有游离端, RecA就能促进入侵的单链同化于双链体DNA中RecA蛋白介导的DNA链交换模型RecBCD复合体具有核酸酶，解旋酶和ATPase活性。在Chi位点产生单链3游离未端.Chi位点可以改动RecBCD的酶活性。一旦RecBCD识别出Chi序列，RecBCD核酸酶活性便发生变化，其35外切酶活性遭到抑制，53外切酶活性被激活，由原来优先降解3末端链，改动为只降解5末端链。但是它的解旋酶活性未遭到影响。 RecBCD酶活性变化的结果是产生3末端带有Chi位点的ssDNA。RecBCD蛋白RecBCD核酸酶从一边开场向chi位点前

14、进, 当它前进时,它降解DNA, 在chi位点,它进展核酸内切, 而后失去RecD,并保管解旋酶活性.RuvA可识别 Holliday的衔接点构造RuvB是ATPase，可发动迁移反响RuvC是一种内切酶， 可特异识别Holliday分枝， 它在体外可切这个衔接体，解离重组中间体。 Ruv 蛋白RuvAB是个不对称的复合体，它推进Holliday结合点的分叉迁移损伤DNA的复制产生间隙RecA介导链交换第二链交换间隙由DNA合成来填补RuvAB介导分叉迁移RuvC切除Holliday衔接点6. 4 位点特异性重组位点特异性重组是发生在DNA上特定序列之间的重组，不依赖于DNA顺序的同源性，由能

15、识别特异DNA序列的蛋白质介导，并不需求RecA蛋白和单链DNA。6. 4 位点特异性重组噬菌体DNA侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长和溶原生长的选择。要进入溶原形状，游离的噬菌体DNA要插入到宿主的染色体DNA中去，这个过程称为整合integration。由溶原生出息入裂解生长，DNA又必需从宿主染色体上切除下来，这个过程称为外切excision。整合和外切 均需求经过细菌DNA和DNA特定位点之间的重组来实现，这些位点称为att位点attachment site。 噬菌体的int编码整和酶来催化整和反响。位点专注性重组的核苷酸序列1. POP: O为15bp(中心)富含A-T的非对称序列

16、； P为-160 0的160bp序列 P为0 80的80bp序列2. BOB: B为-11 0序列 B为0 11序列噬菌体的整合和切除共240bp共23bp经过在attB和attP之间的相互重组，噬菌体环状DNA转变成线性的前噬菌体；而经过在attL和attR之间的相互重组，前噬菌体能被外切出来。-DNA对E.coli的整合： POP + BOB BOPPOB需求整合酶(Int拓扑异构酶活性)和整合宿主因子(IHF)参与-DNA从E.coli的切离： BOPPOB POP + BOB需求整合酶(Int)、整合宿主因子(IHF)和切除酶(Xis)参与。一切这些蛋白质都结合到attL和attR的P

17、和P臂上，而attL和attR中央的中心序列并排对齐陈列促进原噬菌体的切除。噬菌体的整合和切除整合的过程:具有对特异性DNA剧烈亲和力的Int与attP和attB位点结合； Int的拓扑异构酶活性，使两条双链各自断开一条单链，瞬间旋转然后交换衔接，构成Holliday中间体，在另两条单链之间发生同样的断裂重接，从而完成双链间的重组。Int和IHF结合到attP的不同位点，在中心区域的Int识别位点包括被切割位点attB和attP的共同中心序列的交叉切割允许成十字架状的衔接，使相互之间能产生重组衔接点。转 座 在生物的基因组中存在一类特殊的DNA序列，它们可以作为独立的单位从基因组的一个位置挪动

18、到另一个位置，这种可以改动本身位置的DNA序列被称为转座子transposons。 一切的转座子都有两个根本特征。首先，转座子的两端为反向反复序列inverted repeat。第二，转座子至少含有一个编码转座酶transposase的基因。很多转座子还携带有与转座不相关的基因，例如抗生素抗性基因、毒性基因等。这些基因位于转座子内，随转座子一同从一个DNA分子挪动到另一个DNA分子，对基因组的进化产生了非常重要的影响。DNA转座子 一细菌的DNA转座子1. 插入序列 (insertion sequences, IS )插入序列是最简单的转座子。典型的插入序列长7501500 bp，具有1040

19、 bp长的末端反向反复序列。IS元件的两个末端并非是非常准确的反向反复序列。一切的IS元件都含有一个编码区，它编码的转座酶能识别IS元件的末端反复序列，为一种介导转座过程关键蛋白质组分。转座酶对IS元件两个边境的识别保证了IS元件作为一个整体在基因组中挪动。IS元件位于细菌的染色体上，也存在于噬菌体和质粒的DNA分子中。在大肠杆菌的染色体中发现了几个拷贝的IS1、IS2和IS3。F因子中没有IS1，但有一个拷贝的IS2和两个拷贝的IS3。当质粒和染色体上具有一样的IS元件时，质粒可以经过同源重组整合到宿主细胞的染色体上。复合转座子 (composite transposon ) 中心区携带有抗

20、药性标志(Drug marker)，两侧有被称为模块module的IS元件或类IS元件。 每个IS元件都有以倒转反复序列为末端的普通构造，所以复合转座子也是以同样的倒转反复序列为末端的。有些复合转座子两侧IS序列是一样的 ,另一些例子中，模块高度同源但不一样。与IS序列一样，复合转座子的转座也会在靶基因组中产生短的正向反复。Tn3 转座子 Tn3代表另一类更为复杂的转座子。这类转座子的两个侧翼序列不是IS或类IS序列，而是短的倒转反复序列；Tn3的反向反复序列的长度是38bp。在两个倒转反复序列之间有3个基因。 A map of transposon Tn3.转座的分子机制 转座子可以经过两种

21、机制进展转座。一种是保守型转座conservative transpositin，一种是复制型转座replicative transposition。在保守型转座中，转座元件从供体位点上切除，然后插到靶位点上，因此这个机制又叫做剪切粘贴转座cut-and-paste transposition。在复制型转座中，转座子被复制，转座的DNA序列是原座因子的一个拷贝，而不是它本身。因此，复制型转座伴随着转座子拷贝数的添加。 1.保守转座 某些细菌转座子，包括很多IS元件和复合转座子，都是经过一种称为剪切粘贴机制进展转座的。这种相对简单的机制是一个保守的过程，即只需靶序列被复制，而原始的转座子那么不发

22、生复制。2. 复制型转座 进展复制型转座的转座子除了具有编码转座酶的基因外，还具有编码解离酶resolvase的基因以及解离酶的作用位点，即内部解离位点internal resolution site, IRS。 69(四)真核生物DNA转座子 1.玉米胚乳颜色的控制因子花斑色是由于突变呵斥的，而且这种突变不是常规突变，是与一种“控制因子controlling element)的存在引起的。2解释假设有C基因，胚乳合成色素，呈紫色；假设C突变c，胚乳无色素，呈白色。在c胚乳的发育过程中，部分细胞发生恢复突变C，构成色斑。突变发生的越早，色斑就越大。1杂交结论 McClintock以为原来的c突

23、变是由一个“可挪动的控制因子如今称转座子引起的，称为Ds，即解离因子dissociator。它可以插入到C基因中。另一个可挪动的控制因子是Ac，称激活因子activator，它的存在可以激活Ds转座进入C基因或其它基因，也能使Ds从基因中转出，使得突变基因回复突变成野生型基因，这就是著名的Ac-Ds系统。3对突变的解释：Ac-Ds系统为什么总是恢复突变、而且高频率？McClintock以为C突变为c是由于一个“可挪动的控制因子transposable controlling element的插入引起的，她称之为Dsdissociator。 解离因子Ds另外还有一个控制因子Acactivator，它能激活： 激活因子AcDs插入C基因引起突变，或从C基因中转出恢复突变。W: whiteC基因在插入位点上呵斥8bp的正向反复D