《生物化学》本科课件第31章+RNA的生物合成与加工

1、第三十六章 RNA的生物合成和加工 转录(transcription)： 以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。转录的条件：模板原料酶产物配对方向引物DNA(不对称转录）NTPRNA聚合酶mRNA,tRNA,rRNA，小RNAA-U,T-A,G-C5 3不需要DNA复制与转录的比较相同点模板 两股链均复制 模板链转录 合成方式 半保留复制 不对称转录 原 料 dNTP NTP 聚合酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 碱基配对 A-T，G-C A-U，T-A，G-C 产物 半保留的双链DNA 单链RNA引物 需要 不需要不同点以DNA为模板 遵循碱基配

2、对原则 都需依赖DNA的聚合酶 聚合过程都是生成磷酸二酯键新链合成方向为53 复制 转录几个基本概念模板链(template strand) Watson(W) 链、负(-)链(minus strand)、 反意义链(antisense strand)编码链(coding strand) Crick(C)链、正(+)链(plus strand)、 有意义链(sense strand)不对称转录(asymmetric transcription)模板链：反意义链（antisense strand，(-)链） 以该链中的DNA碱基顺序指导RNA的合成即被转录的那条DNA链。编码链：有意义链（sen

3、se strand ，（+）链）不被转录的那条DNA链，但其碱基顺序除T代替U外，其余与mRNA相同。5-GCAGTACATGTC-3编码链 DNA3-CGTCATGTACAG-5模板链5-GCAGUACAUGUC-3 mRNAN -Ala-Val-His-Val-C 蛋白质不对称转录 .DNA双链上，仅一股链转录，另一股不转录。 .有意义链与反意义链并非固定不变。 .转录方向都是5 3转录方向5 3模板链图13-1 （一）RNA聚合酶依赖DNA的RNA聚合酶（DNA-dependent RNA polymerase,DDRP） 以DNA为模板，催化2个游离的NTP形成3，5-磷酸二酯键1、大

4、肠杆菌RNA聚合酶的组成（1）全酶(holoenzyme) 由4种(5个)亚基2组成 还含2个Zn原子（2）核心酶(core enzyme) 2 ，参与转录的全过程（3）亚基（起始亚基） 亦称因子（ factor)转录辅助因子 识别启动子 亚基功能未知全酶核心酶亚基2酶的装配，与启动子元件及活化因子结合结合底物，形成磷酸二酯键（催化）结合模板DNA （核心酶参与转录全过程）识别起始点启动子（延长时脱落）功能转录速度约为50核苷酸/秒模板识别双链DNA局部解开转录起始脱离转录终止转录延伸53NusARNA启动子Promoter 终止子terminator5RNA聚合酶5353553NusA离开转

5、录泡2. 真核细胞RNA聚合酶在DEAE-Sephadex柱上的洗脱次序称为酶、 没有对应于因子的成分，需要转录因子参与类型转录产物rRNA:18s,5.8s,28shnRNA snRNAtRNA,5srRNA, scRNA U6 snRNA对鹅膏蕈碱 的反应不敏感高度敏感不同物种 敏感性不同真核生物RNA聚合酶的转录过程与细菌类似，但是其自身不能识别启动子，需由转录因子识别并与之装配成转录复合物后才开始转录。过程：装配、起始、延伸和终止4个阶段。（二）启动子（promoter）和转录因子1、启动子 RNA聚合酶全酶识别、结合、开始转录的一段DNA序列。（双链）2、转录因子RNA聚合酶起始转录

6、所需要的辅助因子（蛋白质）足迹法（Footprinting）足迹法技术用于测定与特殊蛋白质结合的核酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与启动子之间相互作用的信息并确定了作用位点（启动子）的核苷酸顺序。通过核酸酶消化分离Pr结合的DNA片段足迹法确定启动子序列3、原核生物启动子的特点:(1)DNA序列在转录起始点的5端区(上游区)(2)-10bp处 -TATAAT- (Pribnow box)(3)-35bp处 -TTGACA-原核生物的转录起始亚基辨认-35区RNA pol 全酶移向-10区合成第一个磷酸二酯键5-pppPypN-OH-3转录起始复合物RNA pol( ) DNApppPypN-

7、OH亚基脱落（结合松弛）（结合紧密）转录起始不需引物！16/50RNA聚合酶保护区转录区域终止点10-10TTGACATATAAT转录开始+1翻译开始Purine-35（Pribnow box）辨认结合区转录起始区12/50大肠杆菌启动子共有序列的功能AGTCTTGACAAATTTAAATAACTGTAATPribnow框-10-35识别区16-19bp5-9bp起点 酶与启动子的结合速度解链速度RNA聚合酶因子识别及结合启动子，延长时脱落不参与转录过程，是转录辅助因子识别位点：启动子-35区、-10区原核生物有多种因子识别不同的启动子一般情况下起作用的是-70 由含70RNA聚合酶全酶识别的

8、典型大肠杆菌启动子促进转录TTGACATATAAT-35原核生物RNA聚合酶及其在转录起始区的结合-109/50 70结合过程： 闭和的启动子复合体RNA聚合酶（全酶）中的因子在DNA双链上迅速、随机滑动，寻找到启动子-35区，形成疏松的复合物，DNA双链未解开。开放的启动子复合体RNA聚合酶（全酶）移向-10区和转录起始延长- 转录泡RNA聚合酶（核心酶）与DNA模板紧密结合，沿3 5方向移动解旋作用：DNA解开聚合功能（不具外切酶功能） 杂交螺旋 RNA-DNA形成杂交螺旋 转录产物RNA沿5 3方向延长4、真核生物的起始较原核生物复杂 顺式作用元件 (启动子/增强子) 转录因子(tran

9、scription factor,TF) RNA聚合酶所需的转录因子 -转录因子 （TF）启动子 上游启动子元件(upstream promotor elements,UPE)增强子：远离转录起始点（130kb） 增强启动子转录活性DNA序列 作用与方向、距离无关沉默子：负性调节元件，起阻遏作用 与基因表达调控有关的DNA非编码序列顺式作用元件(cis-acting element)反式作用因子(trans-acting factor)概念：为DNA结合蛋白，可使邻近基因 开放（正调控）或关闭（负调控）特点：三个功能结构域：DNA识别结合域 转录活性域 结合其他蛋白的结合域能识别并结合顺式作用

10、元件(cis-acting element)正调控与负调控A 类别启动子（有种属特异性） 控制rRNA前体基因的转录 近启动子-40+20：决定转录起始的精确位置 远启动子-180-107：影响转录的频率 （核心启动子和上游控制元件） 需要两种转录因子的参与启动子B 类别启动子 基本启动子（basal promoter） 起始子（initiator） 上游元件（upstream element） 应答元件（response element） 需要多种转录因子的参与 TATA框（ 25至-30bp ） 与RNA聚合酶的定位有关 DNA双链解开的部位 辅助因子为通用转录因子 （general tr

11、anscription factor，GTF）以TFIIX来表示，其中X按先后发现次序用英文命名。基本启动子Y为嘧啶碱起始子（initiator，Inr）RNA聚合酶与转录因子的装配TATA-binding protein，TBP形成复合物ATP酶、解旋酶和激酶活性上游元件CAAT框（被CP1、CP2和核因子NF-1识别）GC框（被Sp1识别）八聚体框（octamer，被Oct-1和Oct-2识别）与基本启动子及其转录因子共同调节转录。转录激活因子的诱导调节磷酸/去磷酸化（主要是共价修饰）应答元件应激或信号转导效应因子 类别启动子 为RNA聚合酶III所识别 部分是下游启动子/内部启动子 tR

12、NA 基因：基因内部两个控制元件（box A、box B） 5S rRNA基因：+50+83（3个控制元件box A、中间元件、box B) 需要3种转录因子的参与RNA聚合酶催化的转录过程RNA聚合酶催化各种前体mRNA的合成需要多种TF参与：TF起始参与RNA-pol 转录的TF转录因子功 能TF A稳定TBP及TFB与启动子的结合TF B与TPB结合引进pol- TFF复合物TBP辨认TATA盒TF HATPase、激酶、解旋酶TF F解旋酶，与pol紧密结合20/50 真核生物转录起始复合物的组装启动子TATA盒+ TFD +D-A复合物(TFD+ TFA) + TFB +(RNA聚合

13、酶+ TFF)复合物 +TFE 、TFJ +TFH（解旋酶、蛋白激酶）DNA解旋、RNA聚合酶C-端Ser磷酸化 从起始点向下游移动（三）终止：终止子和终止因子 转录至模板某一位置 停止形成磷酸二酯键 RNADNA杂交链解开 DNA解链的部分重新形成双螺旋 RNA聚合酶离开DNA终止子（terminator）提供转录终止信号的DNA序列终止因子（termination factor）协助RNA Pol识别终止信号的辅助因子抗终止因子（ antitermination factor ）阻碍终止子作用的蛋白 造成通读（readthrough） 如：噬菌体早、中、晚期基因的时序表达终止信号位于已转录

14、的序列中，所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构。其产生的RNA可形成茎环构成的发夹结构。1、转录终止的两种方式（原核）第一类：依赖-因子的终止-因子的结构六聚体依赖RNA的NTP酶活性RNA-DNA解旋酶活性与单链RNA结合-因子的作用与新生RNA结合ATP供能 因子沿新生的RNA单链推进 新生的RNA单链从DNA模板上分离下来 DNA模板上有终止信号转录出来的RNAPol遇此结构停止工作DNA和RNA（dA ：rU） 稳定性下降富含GC/AT的回文结构自身互补形成发夹状结构（hairpin）3尾端有4个UDNA恢复双链，释放转录产物第二类：不依赖-因子的终止Nus A 蛋白置换因

15、子并识别终止子结构，N蛋白可抑制这种识别。N蛋白具有抗终止作用不依赖于的终止子依赖于的终止子抗终止作用（四） 转录的调节控制遗传信息表达有时间特异性 (temporal specificity)（时序性）和适应性（adaptive specificity）1. 时序性:某一基因的表达严格按特定的时间顺序发生。2. 适应性： 适应环境、维持生长和增殖维持个体发育与分化原核生物基因表达的调控(Control of Prokaryotic Gene Exepression )转录水平的调控(control of transcription) 操纵子(operon)细菌基因表达和调控的单位由信息区与调

16、控区组成（正调控与负调控）cAMP能促进许多原核生物的基因表达cAMP活化CRP （cAMP receptor protein）改变其构象，提高对启动子亲和力，促进转录CRP是广谱的正调节物，促进RNA Pol与启动子的结合葡萄糖效应：细菌优先利用葡萄糖， 阻遏利用其它底物的酶类的合成。原因： 葡萄糖的降解物可以抑制AC的活力， 激活磷酸二酯酶 降低cAMP的水平反式作用因子是转录重要的调节方式 通常含有3个结构域 DNA结合域(DNA- binding domain)转录激活结构域二聚化结构域蛋白质与DNA结合区域存在一些特殊的基序结构，常见的有：锌指结构(zinc finger motif

17、)螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)亮氨酸拉链结构 (leucine zipper)螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix,HLH)1、螺旋-转角-螺旋2、锌指结构保守AA的基团锌离子形成相对独立的结构域有两种：Cys2/His2（典型的锌指蛋白，串联重复）Cys2/Cys2（类固醇受体中）结合DNA及二聚化Cys2/His2锌指结构12AA特异结合位点3、借疏水作用形成的亮氨酸拉链bZIP4、HLH（螺旋-环-螺旋）两个两亲性螺旋 以疏水侧形成二聚体 碱性区结合DNA（bHLH）1、嘌呤和嘧啶类似物 核酸代谢的拮抗物： 抑制核酸合成有关的酶 掺入核酸分子形成异常核

18、酸如：6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6二氨基嘌呤、 8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶 、6-氮尿嘧啶 进入体内变成相应的核苷酸表现抑制作用（五）RNA生物合成的抑制作用2、DNA模板功能的抑制物（1）放线菌素D（actinomycin D） 与DNA形成非共价复合物 其作用如同阻遏蛋白抑制DNA转录和复制。 色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素（2）嵌入染料 使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸， 导致移码突变，并能抑制RNA链的起始。（3）烷化剂 使鸟嘌呤烷基化后被水解，有些能使DNA交联。放线菌素D-插入dG*dC间低浓度-(-)RNA延长高浓度-(-)RNA起始 (-)DNA复制与DNA模板作用3、R

19、NA聚合酶的抑制剂利福平抑制细菌RNA聚合酶活性原核生物真核生物利福平/利福霉素利链霉素 与RNA聚合酶亚基结合鹅膏蕈碱 (-)RNA聚合酶与RNA聚合酶作用某些常用的转录抑制剂抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素 细菌的全酶 与亚基结合阻止起始利链霉素 细菌的核心酶 与亚基结合阻止延长放线菌素D 真核RNA Pol 与DNA结合并阻止延长-鹅膏蕈碱 真核RNA Pol 与RNA聚合酶结合二、 RNA的转录后加工/成熟 （post-transcriptional processing）mRNA可直接作为翻译的模板rrRNAttRNA（一） 原核生物RNA的成熟原初转录产物要加工、修饰1、rRNA的

20、加工原核生物rRNA转录初始物:rRNA基因和tRNA基因组成混合操纵子： 16SrDNA tDNA 23SrDNA 5SrDNA tDNArRNA转录初始物: 16SrRNA tRNA 23SrRNA 5SrRNA tRNA加工RNA酶对转录初始物切割再加工成熟RNaseRNaseRNaseE甲基化碱基甲基化核糖2、tRNA的加工原核生物tRNA转录初始物:tRNA基因:型- tRNA 有 3-CCA-OH型- tRNA 无 3-CCA-OHtRNA转录初始物:与rRNA相连几个相同(不同)tRNA连在一起加工RNA酶RNA酶FRNA酶DRNA酶PtRNA核苷转移酶切开rDNA、tDNA转录

21、产物 间隔序列从3端切断前体分子核酸外切酶,切除型tRNA 3-CCA-OH下游序列（核酸+蛋白） （M1RNA）内切酶，tRNA5端成熟酶 催化型tRNA形成稳定的3-CCA-OH（二）真核生物RNA转录后的加工 1、rRNA转录后的加工rRNA的基因 (rDNA)转录产物成簇排列高度重复序列DNA核质:()-不需加工 5s rRNA 核仁:()-加工 5.8s rRNA 28s rRNA 18s rRNA 转录后的加工和与核糖体的装配同时进行前rRNA的切割特点：在特殊序列位点由核仁小RNA(snoRNA)催化，snoRNA+蛋白质 核仁小核蛋白(sno-RNP)2、tRNA的加工碱基修饰

22、3端 5端切除反密码环 的内含子稀有碱基- T脱氨 - AMP IMP还原 - DHU甲基化- mA mG添加CCA-OHRNaseP切除多余的核苷酸RNaseP在前tRNA二级结构基础上3、真核生物的mRNA转录后加工原核与真核生物mRNA的区别原核生物mRNA多顺反子转录与翻译同步mRNA不需加工 寿命短真核生物mRNA单顺反子转录后需加工运至 胞浆再翻译mRNA需加工寿命较长加帽加尾mRNA前体的剪接5端：m7GpppGpN作用:稳定mRNA 5端 和翻译的起始有关3端: polyA尾巴作用：稳定mRNA 和翻译模板活性有关剪除内含子，连接外显子加工过程主要包括：5 pppGp5 Gpp

23、pGppppG ppi鸟苷酰转移酶5 m7GpppGp甲基转移酶SAM5 ppGp磷酸酶 Pi（1）真核生物mRNA转录后加工-“加帽”以5- 5三磷酸相连帽0帽帽m7GpppGpNm7GpppGmpNm7GpppGmpNm三种5帽结构形式步骤1步骤2作用位置200250（2）真核生物mRNA转录后加工-加polyA尾外显子内含子DNA hnRNA（3）真核生物mRNA转录后加工剪接类型自我拼接主要存在真核细胞器基因，低等真核生物核的rRNA基因，细菌和噬菌体的个别基因类型自我拼接只见于真菌线粒体基因和植物叶绿体基因。hnRNA的拼接核内小RNA(snRNA)(100300bp），U系列的sn

24、RNA中尿嘧啶含量高而得名。U1,U2,U4,U5,U6 snRNA 参与hnRNA的拼接。拼接体(spliceosome)的形成真核生物编码蛋白质的核基因含有大量的内含子，内含子的左端为GT，右端为AG，称为GT-AG规则（GU-AG)。分支点与内含子5互补需要U2辅助因子和U1 snRNP片段互补结合成一个核糖核蛋白颗粒分支点供能促使U4和 U6分离U2和 U6互补U5识别外显子拼接点5羟基tRNA前体的酶促拼接23 环磷酸基环磷酸二酯酶2磷酸基3羟基5羟基5磷酸基5- 5酵母反式拼接与选择性拼接降钙素降钙素基因相关肽RNA编辑（RNA editing）介绍（1）一种与RNA加帽、加尾、剪

25、接不同的RNA 加工形式。（2）转录后改变RNA的序列（插入或删除碱 基），使成熟RNA的序列与基因组DNA序列不同。 （3）生物学中心法则的补充，扩大了mRNA 遗传信息容量。 Several types of mRNA editing involving base substitutions can significantly alter the polypeptide products encoded by the RNA sequences 起始密码氨基酸的变化终止密码沉默编辑mRNA编辑的几种类型锥虫线粒体RNA编辑 泛（全）编辑（pan editing）：插入U锚定顺序核酸内切酶末

26、端尿苷酸转移酶RNA连接酶RNA editing in protein-coding regions of mitochondrial transcript from the protozan Trypanosoma brucei四膜虫线粒体COIII基因转录区mRNA的泛编辑人载脂蛋白mRNA（apolipoprotein B）基因编码4563个AA多肽Apo Bl00 肝细胞中合成后分泌到血液中 编码2153个AA多肽Apo B48 在肠细胞中合成 同源载脂蛋白 是载脂蛋白mRNA编辑后的产物 人类载脂蛋白B（Apo B） mRNA的编辑出现一个终止密码载脂蛋白apo-B mRNA的修饰超

27、编辑： 一种修饰的mRNA加工，涉及靶分子广泛的脱氨基，使RNA的50%腺嘌呤核苷酸转变为次黄嘌呤，称为超编辑。 双链RNA腺嘌呤脱氨酶（ dsRADs） mRNA分子中的区段 邻近的内含子顺序 产生双链构型指定修饰的位点 形成特别的配对 腺嘌呤脱氨基插入编辑（insertional editing） 在某些病毒RNA及原生生物线粒体mRNA中出现，涉及面不广。例如副粘病毒P基因在mRNA的特别位置插入鸟苷酸（G）产生至少2个不同的蛋白质。 这些插入事件与引导RNA无关，它们是由RNA多聚酶在合成mRNA时加入的。多聚腺苷酸化（polyadenylation）编辑 这类加工事件多见于动物线粒体mRNA。从人线粒体基因组转录的5个mRNA均以U或UA结尾，而非终止密码UAA或UAG。多聚腺苷酸化可将未端的U或UA转变为UAAA，产生终止密码，这是脊椎动物线粒体为保持足够紧凑的结构而具有的几