《生物化学》本科课件第14章+核酸物理化学性质

1、第14章 核酸物理化学性质一、核酸的水解 酸、碱、酶水解作用于磷酸二酯键和糖苷键DNA/RNA对酸/碱的耐受程度有差别糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解；嘌呤碱比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定；对酸最不稳定的：嘌呤与脱氧核糖间糖苷键（一）酸水解DNA:pH2.8、100加热1h，或pH1.6，37 对水透析可除去嘌呤碱形成无嘌呤酸（apurinic acid，APA）（二）碱水解RNA磷酸酯键被水解生成2/3 -核苷酸DNA则不受影响脱氧核糖无2OH，不能形成碱水解中间产物DNA在1mol/LNaOH中加热至1004h，可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。（三）酶水解磷酸二酯键1、酶分类 根据底物分为： DN

2、ase、RNase 根据作用方式：核酸外切酶 从一端（3/5）逐个水解核酸内切酶 从中间开始在某个位点切断按照作用的化学键 磷酸二酯酶（phosphodiesterase） 断3-OH形成的酯键 5-磷酸核苷 断5-OH形成的酯键 3-磷酸核苷 磷酸单酯酶（phosphomonoesterase） 切去核酸分子末端磷酸基 及核苷酸的磷酸基其它：对底物二级结构的专一性 双链酶：作用于双链核酸 单链酶：作用于单链核酸+PyPyPyPyPyPyPuPuPPPPPPPPPP2H2O2、RNase （1）牛胰核糖核酸酶（RNase ）作用：嘧啶核苷3磷酸与其它核苷酸连键 专一性极高的内切酶产物： 3嘧啶

3、核苷酸/其结尾的寡核苷酸PPPPPPP2H2OPP+OHOHPPPPPGAGAAAGGCUUC （2）核糖核酸酶T1 （RNase T1）作用：3鸟苷酸与相邻核苷酸5OH连键产物：3鸟苷酸或以其为末端的寡核苷酸（3）核糖核酸酶T2 （RNase T2 ） 作用位点为Ap残基 可将tRNA完全降解为3腺苷酸结尾的寡核苷酸DNase：牛胰脱氧核糖核酸酶 Mg2+激活、柠檬酸盐抑制 切断双链或单链DNA 以5磷酸为末端的寡聚核苷酸 DNase ：牛脾脱氧核糖核酸酶 Na+激活；Mg2+抑制 3磷酸为末端的寡聚核苷酸，平均长度为6核苷酸。3、DNase链球菌脱氧核糖核苷酸酶： 内切酶，作用于DNA，

4、Mg2+激活 产物为5磷酸为末端的碎片，长度不一。限制性内切酶(细菌) 主要降解外源DNA 具严格的碱基序列专一性是基因工程最重要的工具酶。 EcoR命名原则 E：大肠杆菌E.coli属名 co：种名的头两个字母 R：大肠杆菌的菌株 ：该细菌中已分离出的这类酶的编号例如EcoR I ，需Mg离子，不需ATP，专一性强，能识别DNA链上6个碱基组成的回文序列，交错切割，形成粘性末端产物。GAATTC CTTAAG GCTTAAAATTC G限制性内切酶通常与甲基化酶成对存在：具有相同的底物专一性，识别相同碱基序列。 甲基供体：S腺苷甲硫氨酸 甲基受体：DNA上的A与C甲基化使细菌自身的DNA带上

5、标记,限制性内切酶专用于降解外来入侵的异种DNA 非特异性的糖苷酶 碱基特异N糖苷酶水解糖苷键4、N糖苷酶二、核酸的酸碱性质具有芳香环结构特点能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 _主要是环内氨基的贡献1、碱基的解离二 胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上腺嘌呤中，质子结合于N1上2、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离3.核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性DNA等电点为44.5；RNA等电点为22.5三、核酸的紫外吸收 碱基含有共轭双键最大吸收峰260nm左右 可用紫外分光光度计加以定量和定性。OD260的应用

6、：1.判断核酸样品的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0含杂蛋白及苯酚，降低2. 纯DNA或RNA的紫外分光定量 OD260=1.0相当于50g/ml双链DNA40g/ml单链DNA（或RNA）20g/ml寡核苷酸有些核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。 ：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径天然DNA的(P）一般为6600 RNA的(P）一般为77007800核酸的(P）值较所含核苷酸单体的(P）要低40%45%；单链多核苷酸的(P）值比双螺旋结构多核苷酸(P）值要高。所以

7、在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大约25%，此现象称为增色效应。在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）判断DNA是否变性四、核酸的变性、复性与杂交(一) 核酸的变性（denaturation） 1、DNA的变性： 在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2、变性的实质降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 高温（一般75） 热变性 强酸、碱 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAG

8、E中DNA ）3、变性因素 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失4、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显完全变性后核酸紫外吸收值增加：天然DNA 2540%、RNA 约1.1%实质：碱基暴露由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称增色效应DNA变性5、DNA热变性的特征变性过程是“跃变式”的，而非渐变解链曲线：连续加热DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线。指增色效应达50%时的温度一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间 Tm：DNA变性时，OD260达到最大值的50%时的温度

9、称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。大小与G+C含量成正比。（1）DNA的均一性：（2）GC含量： 经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44（3）介质中的离子强度： Tm值大小与下列因素有关：均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性 。测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）2.44P509图5-19 图14-5 Tm值与GC含量的关系不易用稀电解质保存DNA(二)核酸的复性（renaturation）变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链复性。复性的程度、速率与复性条件有关：热变性DNA骤然冷却（淬火）不可能复性将变性DNA缓慢冷却（

10、退火）可以复性热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。DNA复性分子量越大复性越难；浓度越大，复性越容易；DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。减色效应（低色效应）复性时紫外吸收减少的现象用Cot1/2表示复性的速度Co：代表变性DNA复性时的初始浓度 t：复性时间Cot1/2复性一半所需时间与DNA浓度的乘积单位：mol s/L(三) 核酸的杂交热变性的DNA单链，在复性时与同源DNA互补链形成双螺旋结构；与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。形成的新分子称为杂交DNA分子。 DNA单链与互补RNA链间也

11、可发生杂交探针（probe）：带有同位素标记或生物标记的核酸片段。核酸分子杂交的应用：研究DNA分子中某一种基因的位置检测两种核酸分子间的序列相似性检测某些专一序列在待检样品中存在与否是基因芯片技术的基础 Southern杂交 Northern杂交 Western杂交1、 Southern BlottingDNA样品 酶切 电泳 碱变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影变性（NaOH 0.5mol/L）转膜（NC膜，尼龙膜）固定（80，4-6h）杂交（高盐浓度，68，几小时）Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。2、 Northern

12、 Blotting研究对象是RNA，探针一般是DNA。总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）3、 Western Blotting抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。测试题1.多核苷酸之间的连接方式是A. 2, 3磷酸二酯键 B. 3,5磷酸二酯键C. 2 ,5磷酸二酯键 D. 糖苷键 E. 氢键2. DNA合成需要的原料是A. ATP,CTP,GTP,TTP B. ATP,CTP,GTP,UTPC dATP,dCTP,dGTP,dTTP D dATP,dCTP,dGTP,dUTP E dAMP,dCMP,dGMP,dTMP 3. 关于Watson and

13、 Crick 的DNA双螺旋模型，那种说法是错误的A. 组成双螺旋的两条DNA 链反向平行B. 碱基对位于双螺旋的内侧C. 维系双螺旋结构的作用力主要是碱基堆积力 D. DNA 双链是左手螺旋1.B; 2,C, 3,D4. DNA和RNA共有的成分是A. D 核糖 B. D 2-脱氧核糖 C. 鸟嘌呤 D. 尿嘧啶 E. 胸腺嘧啶5. DNA和RNA彻底水解后的产物是A. 戊糖相同，部分碱基不同 B. 碱基相同，戊糖不同C. 戊糖相同，碱基不同D. 部分碱基不同，戊糖不同E. 碱基相同，部分戊糖不同6. 核酸具有紫外吸收能力的原因是A. 嘌呤和嘧啶环中有共轭双键B. 嘌呤和嘧啶中有酮基C. 嘌

14、呤和嘧啶中有氨基 D. 嘌呤和嘧啶连接了核糖 E. 嘌呤和嘧啶连接了磷酸基团4. C; 5. D; 6. A7. 组成核酸的基本单位是A. 嘌呤碱与嘧啶碱 B. 核糖与脱氧核糖 C. 核苷 D. 核苷 酸 E. 寡核苷 酸 8. 在核酸结构中含量较稳定的元素是A. C B. H C. O D. N E. P9. tRNA的二级结构为A. 双螺旋 B. 超螺旋 C. 线形 D. 三叶草形 E. 倒“L”形 10. 碱基互补配对形成的键是 维持碱基对之间堆积力的是 核苷酸之间的连接键是 核酸分子中紫外吸收较强的键是 不利于维持双螺旋稳定的力是 A. 氢键 B. 磷酸二酯键 C. 范德华力 D. 碱基中的共轭双键 E. 静电斥力7. D；8.P；9.D；10.A,C,B,D,E11. 假尿嘧啶核苷酸的糖苷键是A. C-C 键