《生物化学》本科课件15 16章 基因工程与PCR

1、 基因技术大连医科大学 生物化学与分子生物学教研室孔英 教授人类基因组：3 x 109 bp细菌基因组大肠杆菌： 4 x 106 bp如何研究基因的结构、功能如何检测基因的表达水平基因表达调控机制、调控后表达变化 基因工程 Genetic engineering 重组DNA技术 Recombinant DNA Technology本章教学要求基因工程所需的酶、载体、操作过程分子杂交PCR原理、过程及应用转基因动物、克隆动物、基因敲除基因诊断、基因治疗方法、意义基因技术(4学时) Creating Dolly！1997年2月，英国“Nature”刊登了爱丁堡罗斯林研究所维尔穆特的研究成果，即“多

2、莉”羊的克隆成功，从此震惊了世界。取一普通绵羊乳腺细胞 将细胞核移植到一个剔除细胞核的卵子中 使之融合、分裂、发育成胚胎 移植到第三头羊的体内共培育277个胚胎，只有多莉成功出生核移植：利用显微外科手术将胚胎细胞或成体细胞的细胞核移入去核的卵母细胞中，构建成重组胚，培养后、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术，又称动物克隆。根据核供体来源不同，分为胚胎细胞克隆动物和体细胞克隆动物。1998年4月与威尔士山羊戴维产下邦尼，证明克隆动物也能生育。2003.2.14日多莉因早衰并患有肺炎，被迫实施了安乐死。由于早衰问题，人们怀疑“多莉是穿着羔羊服装的老羊” 多莉的生命历程克隆(clone)

3、来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆(DNA cloning)细胞克隆器官（或组织）克隆个体克隆（动物或植物） DNA 重组技术 (Recombinant DNA techniques) 利用限制性内切酶、连接酶等在体外将不同生物体 DNA 片段 进行重新组合的技术。重新组合的 DNA片段称重组 DNA 分子 又称分子克隆（molecular cloning） DNA克隆（DNA cloning） 基因克隆（gene cloning) 基因工程（ Genetic en

4、gineering ）（目的基因的无性繁殖） 利用DNA 重组技术将目的基因与载体重组，再导入受体细胞 进行扩增和表达基因组 DNA克隆载体限制性内切酶消化限制性内切酶消化、电泳分离、纯化DNA 连接酶重组DNA分子转化或转导大肠杆菌宿主细胞细胞增殖分子克隆的基本过程在大肠杆菌宿主细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝目的DNA片段能自主复制的遗传元件基因组 DNA载体 (环状 DNA)可被克隆的目的 DNA 片段线状 DNA 载体筛选含目的基因的重组子限制性内切酶限制性内切酶转化或转导大肠杆菌重组 DNA 分子组 织mRNAcDNA部分或全部酶切的 DNA加衔接物分子DNA 连接

5、酶反转录分分切接切接转转筛筛克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。因此，重组DNA技术又称为基因工程技术 工具酶 载体 目的基因 基因组 DNA 文库筛选、PCR 产物 cDNA文库筛选、RT-PCR 产物 化学合成 宿主细胞 导入重组 DNA 分子到宿主细胞 筛选携带目的基因的宿主细胞分子克隆的所需的条件工具酶在重组DNA技术中特殊用途工 具 酶功 能限制性内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个D

6、NA分子或片段连接碱性磷酸酶切除末端磷酸基反转录酶合成cDNA；替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析末端脱氧核苷酰转移酶 在3羟基末端进行同聚物加尾DNA聚合酶合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；DNA序列分析；填补3末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等Taq DNA聚合酶 常用于PCR；产物的3末端带有A，可用于T-A克隆多核苷酸激酶催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针限制性内切酶和修饰酶(Restriction endonuc

7、leases and modifying enzymes) 一、限制性内切酶用于切割DNA限制性内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制性内切酶是重组DNA技术中重要的工具酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H“限制性” 限制性内切酶只降解外源 DNA 而不降解宿主 DNA；“内切酶”是指酶切位点在 DNA 分子内，而不是两端。ApR: Ampicillin resistance generep (ori): replication originlacZ: N-t

8、erminal -galactosidaseMCS: multiple cloning sitesMCS (pUC18 )限制性内切酶的分类同一细菌株中不同的限制性内切酶被发现和分离的顺序，用罗马字表示属名(大写)EcoRI种名(小写)细菌株名(大写)Escherichia 属coli 种R株第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写斜体；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写斜体；第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；用罗马数字表示发现的先后次序。类型 II 限制性内切酶1.回文结构 (palindrome) 是双链 DNA 分子中的反向重复结构，即每条链从 5 3 方向读其核苷酸序列都

9、相同。5 GGATCC 33 CCTAGG 55 AGATCT 33 TCTAGA 55 CCCGGG 33 GGGCCC 52. 识别序列(1) 具有回文结构BamHI5 GGATCC 33 CCTAGG 5KpnI5 GGTACC 33 CCATGG 5(2) 具有间断的回文结构HinfI (XmnI)5 GANTC 33 CTNAG 5(3) 具有简并性碱基HincII5 GT(T/C)(A/G)AC 33 CA(A/G)(T/C)TG 5(4) 无回文结构MboII5 GAAGA(N)8 33 CTTCT(N)7 5GAATTCCTTAAGCTTAA5 -3 -3 -5 5 -3 -3

10、 -5 GAATTCG 5 P- 3 OH - OH 3 - P 5 CTGCAGGACGTC5 -3 -3 -5 CTGCA5 -3 -G - OH 3 - P 5 ACGTC 5 P-3 OH-G-3 -5 EcoRIPstI3. 经限制性内切酶酶切后所产生的末端类型(1) 粘性末端 (sticky ends, cohesive ends)5 凸端 (5 overhang) 粘性末端3 凸端 (3 overhang) 粘性末端CCCGGGGGGCCC5 -3 -3 -5 5 -3 - OH 3 - P 5 CCCGGGGGGCCC 5 P -3 OH-3 -5 SmaI-3 -5 5 -3

11、 -5 -3 - OH 3 - P 5 GGCC 5 P - 3 OH-3 -5 CCGGGGCCCCGGHaeIII(2) 平端或钝端 (blunt ends)同尾酶（isocaudarner） 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的黏端，这样的酶彼此互称为同尾酶。这两个相同的黏端称为配伍末端(compatible end)。Bam HBg l GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A4. 不同的酶可以产生同样的末端 GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam HGGATCCC

12、CTAGGGCCTAGGATCC G+BstCCCGGGGGGCCCCCCCGGCCGGG G+XmaCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+Sma能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。 5. 不同的酶可以识别同一个序列 酶活性单位：在 37C (某些限制性内切酶用 25C 或 50C) 条件下，每1小时酶切 1 g DNA 所用的酶量。6. 类型 II 限制性内切酶的反应条件常用的酶反应体系为 50 l，即10X 缓冲液5 lDNA2 gddH2O42.5 l限制性内切酶 (10U/l)0.5 lT4 DNA 连接

13、酶 (T4 DNA ligase) 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase)-去除核酸分子末端的磷酸基团DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow)T4 DNA 聚合酶 (T4 DNA polymerase)T7 DNA 聚合酶 (T7 DNA polymerase) Taq DNA 聚合酶 (Taq DNA polymerase) 逆转录酶 (Reverse transcriptase)-以RNA为模板合成cDNA末端脱氧多核苷酸转移酶 (Terminal deoxynucleotidyl transferase) -用于给DNA末端加尾以构成黏性末端 多核苷酸激酶 (Pol

14、ynucleotide kinase)使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化DNA 核酸酶 I (DNA nuclease I)S1 核酸酶 (S1 nuclease)外切核酸酶 III (Exonuclease III) 外切核酸酶 ( Exonuclease)修饰酶 (Modifying enzymes)T4 DNA 连接酶, ATPTGCTTAA5 - 3 -ACG-OH 3 -P 5AATTCGTGCA- 3 - 55 P - 3 OH -TGCTTAA5 - 3 -ACG AATTCGT GCA- 3 - 5T4 DNA 连接酶 (T4 DNA ligase)催化 DNA 的 3-OH 和 5

15、-P 之间形成磷酸二酯键连接带粘性末端的两个 DNA 分子T4 DNA连接酶, ATPACG5 - 3 -TGC-OH 3-P 5TAGCCGTATCGGCA- 3 - 5 5 P - 3 OH -5 - 3 -TGCTAGCCGTACGATCGGCA- 3 - 5连接带平端的两个 DNA 分子 粘性末端平端 大肠杆菌DNA聚合酶I（DNA polymerase I）是基因工程中常用的DNA聚合酶。具有53聚合酶活性外 35及53核酸外切酶活性 常用于DNA探针缺口平移法（nick translation）标记。 DNA聚合酶I主要用于合成DNAE.coli DNA聚合酶 I Klenow片段

16、Klenow片段是 E.coli DNA 聚合酶 I 的羧基端片段，长度为全酶的 70。具有 5 3 聚合酶活性及 3 5 外切酶活性。蛋白酶酶切位点 Klenow 片段 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 EcoRI5 G 3 5 AATTC 33 CTTAA 5 3 G 5 Klenow, dNTPs5 GAATT 3 5 AATTC 33 CTTAA 5 3 TTAAG 55 3 聚合酶活性：补平限制性内切酶酶切所产生的 3 凹端而形成平端 5 GGTACC 3 3 CCATGG 5 KpnI5 GGTAC 3 5 C 33 C 5 3 CATGG 5 Klenow5 G 3 5

17、 C 33 C 5 3 G 53 5 外切酶活性：去除限制性内切酶酶切所产生的3凸端而形成平端Taq DNA聚合酶常用于PCR 具有良好的聚合活性和热稳定性，常用于PCR。 具有53聚合酶活性及53外切酶活性 没有35外切酶活性，因而无校对活性 故在PCR反应中如果发生碱基错配，该酶没有校正功能 目前研发多种高保真耐高温DNA聚合酶，降低PCR碱基错配 Taq DNA聚合酶具有末端转移酶作用，能在所合成DNA链的3末端加上一个单独的腺苷酸残基（A）。这样PCR产物可直接与带有3-T的线性化载体（T载体）连接（即T-A克隆）。逆转录酶 (Reverse transcriptase，RT) 逆转录

18、酶为依赖 RNA的 DNA聚合酶，具有 5 3 聚合酶活性外，以 RNA为模板合成 DNA。 逆转录酶还具有核糖核酸酶H (RNase H) 活性，可 从 5 末端或 3 末端降解RNA:DNA杂合链中的 RNA。 逆转录酶无 3 5 外切酶活性。禽类逆转录酶和鼠类逆转录酶的比较以 mRNA为模板合成第一条 cDNA链，所用的引物包括 Oligo (dT)12-18特定序列的寡核苷酸 随机序列的寡核苷酸 构建 cDNA 文库：用 Oligo (dT)12-18 引物 克隆特定的 cDNA：用特定序列的寡核苷酸引物 RT-PCR：用特定序列的寡核苷酸引物 制备 cDNA 探针：用特定序列的寡核苷

19、酸引物或 随机序列的寡核苷酸引物MMLV RT催化的 cDNA合成 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase，BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase，CIP）。用于脱去DNA（RNA）5末端的磷酸基团，使5 -P成为5 -OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。碱性磷酸酶能去除核酸分子末端的磷酸基团 P5OH3OH3P5OH5OH3OH3OH5 5 35533 53OHGGG GGdGTP末端转移酶末端脱氧核苷酰转移酶用于给DNA末端加尾以构成黏端 多核苷酸激酶可使寡核苷酸链5羟基末端磷酸化 常用的是T4多核苷

20、酸激酶（T4 polynucleotide kinase），该酶含5多核苷酸激酶和3磷酸酶活性，能催化ATP的-位磷酸向DNA和RNA的5-羟基转移。 该酶常用于： DNA或RNA的5末端标记； 使没有5-末端磷酸的DNA片段磷酸化，以供连接和克隆之用。载体和宿主细胞 (Vectors and Host cells)载体（vector）是为携带感兴趣的外源DNA，实现外源DNA在受体细胞中的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子 按功能分克隆载体（cloning vector）表达载体（expression vector） 按基本元件的来源不同质粒载体噬菌体载体黏粒载体病毒载体人工

21、染色体载体等载体概述载体 (Vectors) 克隆载体 (Cloning vector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体(用于构建基因组文库、cDNA文库、克隆某一特定基因或 cDNA 以测定其核苷酸序列。 (1) 质粒 (plasmid) (2) 噬菌体载体 ( phage) (3) 粘粒 (cosmid) (4) 细菌人工染色体 (Bacterial artificial chromosome, BAC) (5) 酵母人工染色体 (Yeast artificial chromosome, YAC) 表达载体 (Expression vector)为使插入的外源DN

22、A序列可转录和翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 用于表达某一基因或 cDNA以获得目的蛋白质，包括原核表达载体和真核表达载体，可根据要表达的目的蛋白的特点来选则载体。（一）克隆载体应具备的主要特点至少有一个复制起点（origin of replication, ori）至少有一个选择性标志（selection marker）多个有适宜的限制性内切酶的单一切点：称多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）应有较高的拷贝数。 pBR322质粒图谱 克隆载体宿主细胞载体结构外源插入片段质粒大肠杆菌环状质粒0.1 - 10 kb 噬菌体载体大肠杆菌线状病毒8 - 25

23、 kb粘粒大肠杆菌环状质粒35 - 45 kb细菌人工染色体大肠杆菌环状质粒50 - 300 kb酵母人工染色体酵母线状染色体100 - 1000 kb不同类型克隆载体的比较用于外源DNA的克隆和无性繁殖 质粒是存在于细菌染色体 (基因组) 外的 DNA 分子，其大小在 1 kb - 200 kb 范围内。 质粒是双链、共价闭合的环状 DNA 分子，以超螺旋形式存在，带有某些遗传信息。 质粒具有复制起始点，可在细胞中进行自我复制，并将质粒 DNA 分配给子细胞。高拷贝数质粒：10-200个/细胞低拷贝数质粒：几个/细胞 质粒还含有在特定环境条件下所必需的基因，如抗生素的抗性基因。质粒 (pla

24、smid)质粒载体所携带的复制子基因组 DNA质粒 DNA细菌基因组 DNA 和质粒 DNA超螺旋质粒 DNA闭环质粒 DNA细菌克隆质粒 (Cloning plasmid)(1) 为低分子量且高拷贝数质粒。低分子量的质粒易于提取并且不容易发生断裂；高拷贝数质粒可大量扩增被克隆的目的基因、DNA 片段或 cDNA。(2) 含有一个或几个可供选择的标记，包括抗生素的抗性基因、细菌的 lacZ 基因片段及 ccdB 致死基因等。(3) 含多克隆位点 (Multiple cloning site, MCS)，即在质粒的基因内有多个限制性内切酶单一识别位点，并允许外源 DNA 插入。抗生素的作用位点C

25、CONHCCCNOSHCH3HCH3HOOCH2NH氨苄青霉素-内酰胺环-内酰胺酶作用位点抗生素的抗性基因产物及其功能ApR: Ampicillin resistance generep (ori): replication originlacZ: N-terminal -galactosidaseMCS: multiple cloning sitesMCS (pUC18 ) 克隆质粒带有E. coli 乳糖操纵子的 lac 启动子及编码 - 半乳糖苷酶氨基端 (-供体片段，146 氨基酸) 的 DNA 片段。 E. coli 宿主细胞 (DH5, JM109, XL1-Blue 菌株)的乳糖

26、 操纵子的 -半乳糖苷酶基为缺陷型，只能编码 -半乳糖 苷酶的羧基端片段 (-受体片段)。 异丙基 -D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导质粒上的 -供体 片段和宿主细胞的 -受体片段的表达，两者结合后才有 -半乳糖苷酶活性，使底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖 苷 (X-gal) 产生蓝色。两个无活性片段组合而成为功能完 整的 -半乳糖苷酶的过程称为 -互补。-互补 (-complementation)lacIPlacOCRP siteMCS lacZ”PlacOCRP site质粒 lacZ宿主细胞基因组无外源 DNA 片段 插入 MCS-半乳糖苷酶氨基端 (-供体片段)IPTG 诱

27、导-半乳糖苷酶羧基端 (-受体片段)水解 X-gal (蓝色菌落)-互补lacIIPTG 诱导-供体片段-受体片段-半乳糖苷酶活性X-gal.转 化-半乳糖苷酶氨基端-半乳糖苷酶氨基端-半乳糖苷酶羧基端-半乳糖苷酶-半乳糖苷酶水解 X-gal，菌落呈蓝色lacIPlacOCRP site外源 DNA 片段外源 DNA 片段破坏 lacZ外源 DNA 片段 插入 MCS质粒宿主细胞基因组 lacZ”PlacOCRP site-半乳糖苷酶羧基端lacIIPTG 诱导IPTG 诱导无 -半乳糖苷酶氨基端产生 无 -半乳糖苷酶活性不水解 X-gal (白色菌落).外源 DNA 片段破坏 lacZ转 化

28、无 -半乳糖苷酶氨基端-半乳糖苷酶羧基端无 -半乳糖苷酶活性不水解 X-gal，菌落呈白色 噬菌体 由 噬菌体改造而成的载体，可容纳 5-25 kb的外源 DNA 片段，常用于构建基因组文库或 cDNA 文库。(1) 插入型载体 只有一个目标位点可供外源 DNA 插入的载体为插入型载体。可在克隆位点插入 5-11 kb 的外源 DNA 片段。(2) 置换型载体 在非必需 DNA 两侧有一对克隆位点的噬菌体载体称作置换型载体。中部的 DNA 由外源 DNA 片段 (8-25 kb) 所置换。 噬菌体载体 ( Phage vector)外源 DNA重组 DNA 分子体外包装携带重组 DNA 分子的

29、 噬菌体DNA 连接酶限制性内切酶(1) 粘粒载体是质粒和 噬菌体的重组体，将含有 cos 位 点的部分 DNA 插入到质粒中即构建成粘粒载体。(2) 粘粒载体可容纳 35-45 kb 的外源 DNA 片段，用于构 建基因组 DNA 文库。(3) 粘粒载体可经体外包装而形成感染颗粒，然后转导入 大肠杆菌，具有较高的转导率。粘粒 (Cosmid)(1) BAC是环状 DNA 分子，包括 MCS 抗生素抗性基因、 复制子：来源于大肠杆菌 F 因子 RepE：调节复制复合物在复制位点处组装 parA-C 基因：确保子细胞含有单拷贝质粒 cos 位点：用于噬菌体外壳蛋白包装(2) BAC 可容纳至 1

30、 Mb 大小的外源 DNA 片段。用电穿孔 方法将 BAC 与外源 DNA 片段的连接物导入大肠杆菌 或经噬菌体外壳蛋白包装后转导大肠杆菌。 细菌人工染色体(Bacterial artificial chromsome，BAC) 宿主细胞的选择由所用的载体来决定，即细胞必须与载体匹配。1. 克隆用宿主细胞(1) 基因组修饰的大肠杆菌菌株，如 DH5, NovaBlue, JM109, XL1-Blue 等(2) 酵母细胞 Saccharomyces cerevisiae2. 表达用宿主细胞(1) 大肠杆菌菌株，如 BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS 等(2) 酵母细胞(3) 昆

31、虫细胞系(4) 各种高等真核生物组织细胞宿主细胞 (Host cells)转化 (Transformation)：将外源 DNA 导入细菌的过程。转染 (Transfection)： 将外源 DNA 导入真核细胞的过程。 转导 (Transduction)：利用噬菌体将外源 DNA 导入细菌 的过程。感染 (Infection)： 利用病毒将外源 DNA 导入真核细胞的 过程。载体导入宿主细胞的方法 感受态细胞 (Competent cells) 是有利于外源 DNA分子进入的细胞。所用的转化方法不同，处理细胞使其进入感受态的方法也不同。 化学转化 (Chemical transformati

32、on) 用 30 mM-100 mM 的 CaCl2 处理大肠杆菌，细胞周围的 CaCl2 促进 DNA 结合到细胞表面并增加细胞对 DNA 的 通透性。转化率为 5 X 106-2 X 107 转化子/g DNA。 物理转化 (Physical transformation) 电穿孔法 (Electroporation): 当细胞经受高压电流脉冲 时，细胞膜上可逆地形成小至 2 n m大小的孔洞，介质中 的 DNA 分子很容易通过孔洞进入细胞质。转化率为 109 转化子/g DNA。转化方法风格法如何获得目的基因(1) 基因组文库中获得(2) cDNA文库中获得(3) 通过PCR技术获得 (

33、4) 人 工 合 成 ,基因组 DNA 的制备(Preparation of genomic DNA)从细胞或组织中提取的基因组 DNA 可用于: 建立基因组文库； 克隆特定的基因； 用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数； 用 PCR 反应检测基因的存在和突变等； 蛋白酶 K 和 SDS 可破坏细胞膜及细胞中的蛋白质，使 基因组 DNA 从破碎的细胞中释放出来。 酚/氯仿去除核酸溶液中的蛋白质以纯化 DNA。 盐离子存在时乙醇或异丙醇沉淀基因组 DNA以浓缩 DNA。 从 1 g 哺乳动物组织或 109 培养细胞中可得到 2 mg 基因组 DNA。从细菌或真菌中制备基因组 DN

34、A 时，首先用溶菌酶破坏其细胞壁结构。基因组DNA的制备原理(1) 细胞裂解 在 50C条件下用裂解缓冲液 (100 mM NaCl；10 mMTris-Cl, pH 8.0；25 mM EDTA, pH 8.0；0.5% SDS；0.1 mg/ml 蛋白酶 K； 100 g/ml RNase A) 消化组织细胞 16-18小时；消化培养细胞 2-3 小时。(2) 蛋白质淬取 用酚/氯仿/异戊醇 (25/24/1) 淬取蛋白质。(3) 基因组 DNA 沉淀 用 0.1 倍体积的 3 M NaAC 和 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀 DNA, 用 70% 乙醇除去 DNA 沉淀中的盐离子。

35、(4) 将基因组 DNA 溶解在 TE 缓冲液中，使其终浓度为 1 mg/ml，置 4C 保存。基因组DNA的制备方法(1) 防止内源性 DNase 应快速分离、剪切、匀浆组织或快速洗涤培养细胞。一旦组织 被冷冻或培养细胞被加到裂解缓冲液中，DNA 将免于被 DNase 降解。尽量将组织切得小一些，便于蛋白酶 K 和 SDS 快速、有 效的作用于组织块。(2) 保证得到高分子量的基因组 DNA，以便于构建基因组文库。 应减少物理机械作用，如不要使用旋涡振荡仪等。(3) 保证基因组 DNA 不被蛋白质所污染，否则将影响限制性内切酶 对 DNA 的酶切作用。高纯度 DNA 的 OD260/OD 2

36、80 值大于 1.8； 50% 蛋白质 /50% DNA 混合物的 OD260/OD280 值大约为 1.5。制备基因组DNA时的注意事项小鼠基因组 DNA1. 未被酶切的 DNA2. HindIII 酶切产物3. MboI 酶切产物1 2 3基因组DNA的检测总 RNA 的制备(Preparation of total RNA) 从组织或细胞中提取总 RNA 的目的是: 纯化 mRNA； 建立 cDNA文库； 克隆特定的 cDNA； 用 Northern 印迹方法检测某一特定基因的表达； 用 RT-PCR 方法检测某一特定基因的表达。 异硫氰酸胍和十二烷基肌氨酸钠为强烈的蛋白质变 性剂，能迅

37、速溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，使 总 RNA 从细胞中释放出来。 异硫氰酸胍和 -巯基乙醇等还原剂使内源性 RNA 酶 (RNase) 变性失活, 防止 RNA 被降解。异硫氰酸胍法提取总 RNA焦碳二乙酯 (DEPC) 使外源性 RNase 变性并失活。 用 0.1% DEPC 处理 ddH2O 16-20 小时，再用 DEPC- ddH2O 配制缓冲液，然后高压灭菌除去 DEPC。 用 0.1% DEPC 浸泡 EP 管、Tip 头 16-20 小时，然 后高压灭菌除去 DEPC。 置玻璃匀浆器、量筒和烧杯等于 180C 烤箱中烘烤 小时。提取 RNA 时所用缓冲液及器皿的处理用 TRI

38、zol 试剂 (Invitrogen/GIBCO 公司) 提取总 RNA的方法 ; TRIzol 试剂的主要成分为异硫氰酸胍、-巯基乙醇和十二烷基肌氨酸钠。用 TRIzol 试剂处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质沉淀 RNA洗涤 RNA 沉淀用 RNase-free ddH2O 溶解 RNA，并置-20C保存检测 RNA (加l RNA到% 琼脂糖凝胶中)总RNA提取过程 rRNA 80%哺乳动物细胞的总 RNA tRNA 和 snRNA 10% mRNA 1-3%MRNA分子量标准 (RNA ladder)1, 2人肝细胞总 RNA 28S rRNA (5025 bp) 18S rRNA (1

39、868 bp)28S rRNA 条带强度是18S rRNA 条带强度的 2 倍。RNA 的检测线状 DNA(Linear DNA, L) 超螺旋 DNA (Supercoiled DNA, SC)带缺口的闭环 DNA (Opened circular DNA, OC) 闭环 DNA (Closed circular DNA) (2) 质粒的电泳加样孔OC L SC 5 kb4 kb850 bp3 kb1 kb2 kb 1.6 kb650 bp500 bppUC18 质粒 DNADNA/RNA 电泳(DNA/RNA Electrophoresis)电泳 (electrophoresis)带电荷物

40、质在电场中移动的现象叫电泳。 DNA 或 RNA分子带负电荷，在电场作用下，DNA 或 RNA 分子由负极向正极移动。 DNA 或 RNA 分子量越大，迁移速率越慢，反之， 分子量越小，迁移速率快。 不同构象的 DNA 或 RNA 分子，迁移速率不同。DNA 或 RNA 电泳原理 用琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定和纯化 DNA 分子 用变性琼脂糖凝胶电泳分离和鉴定 RNA 分子 用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DNA 测序反应中 合成的系列单链 DNA 片段 (5-500 bp)核酸电泳类型 VmA 迁移方向电泳仪样品槽负极正极电泳缓冲液水平电泳槽琼脂糖凝胶槽 琼脂糖 (agarose) 是 D- 和

41、 L-半乳糖残基通过 -(13) 和 -(14) 糖苷键交替构成的线状聚合物，琼脂糖凝胶 可形成孔径为 50 nm 到 200 nm 的分子筛。 琼脂糖凝胶的分辨率较低，但分离范围较大。DNA 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶浓度与线状 DNA 分子的有效分离范围琼脂糖凝胶浓度 (%)线状 DNA 分子的有效分离范围 (kb)0.530 1.00.712 0.81.010 0.51.27 0.41.53 0.2常用电泳缓冲液6X 样品缓冲液0.25 溴酚蓝0.25 二甲苯氰 FF40 蔗糖(1) 溴酚蓝和二甲苯氰 FF 在电场中向正极移动，用来预测 DNA 样品的电泳情况。在 0.5X TBE琼脂糖凝

42、胶电泳中: 溴酚蓝 300 bp 的线状双链 DNA 二甲苯氰 FF 4000 bp 的线状双链 DNA(2) 蔗糖可以增加样品密度以保证 DNA 沉入加样孔内。样品缓冲液NH2C2 H5H2N N+Br-溴化乙锭 (Ethidium bromide, EB)EB/2.5 碱基琼脂糖凝胶中 DNA 的检测EB 染色方法EB 终浓度： 0.5 g/ml(1) 将 EB 直接加入琼脂糖凝胶中染色。 便于观察 DNA 的电泳情况，但 EB 嵌入 DNA 分子 后， 会改变 DNA 分子的迁移速率 。(2) 电泳结束后将琼脂糖凝胶浸入 EB 染色液中染色。注意：EB 是潜在的致癌剂，须小心操作。SYB

43、R (绿色荧光染料) 安全性高； 敏感性是 EB 的 2 倍； 用于 DNA 和 RNA 的染色； 检测方便激发光波长：280 nm 和 502 nm 发射光波长： 530 nm可用紫外光透射仪、可见光透射仪或激光扫描仪检测。 二甲苯氰 FF 溴酚蓝 凝胶电泳成象结果 为防止单链 RNA 形成空间结构，需用变性的琼脂糖 凝胶即甲醛-琼脂糖凝胶分离 RNA分子。 为防止外源性 RNase 的污染，所用的托盘、梳子、 倒胶槽、电泳槽等需要用焦碳酸二乙酯 (DEPC) 或 H2O2处理；所用的缓冲液要用 DEPC 处理的 ddH2O 来配制。 注意：DEPC是潜在的致癌剂，须小心操作。RNA 琼脂糖

44、凝胶电泳110X MOPS 电泳缓冲液200 mM MOPS 3-(吗啉代)-丙磺酸, pH 7.050 mM NaAc10 mM EDTA, pH 8.0 使用前，将 10X MOPS 稀释至 1X MOPS2甲醛-琼脂糖凝胶的制备 甲醛的终浓度：7.73电泳前 RNA 样品的处理 用甲醛和甲酰胺等处理 RNA 样品以打开的 RNA 发 夹结构4电泳结束后用 EB 染色液染色。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨率较高，所以聚丙烯酰胺凝 胶电泳用于分离 DNA 测序反应中的系列 DNA 片段。 在聚丙烯酰胺凝胶中加入了尿素作为变性剂，以确 保 DNA 片段保持单链状态并以线状 DNA分子的形 式泳动。 所

45、用的电泳缓冲液为 1X TBE。 大型垂直板电泳变性聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)一. PCR 的基本原理 根据细胞分裂中 DNA 半保留复制机理在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。利用DNA变性与复性原理在体外扩增特异DNA片段,在一个简单的试管中反应，用极少量基因组DNA作模板,在一对引物介导下，通过聚合酶链式反应，在短时间内即可将所需目的DNA片段扩增至100万倍以上PCR技术 特点 敏感度高、特异性强、产率高、 重复性好、操作简便、快速 PCR工作原理是以要扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核

46、甘酸片段为引物、在4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。 PCR特异性取决于人工合成的一对引物和模板DNA结合的特异性。 PCR体系基本组成模板DNA： （102-5）拷贝dNTP底物：20200umol/L，过高将加快反应速度， 同时增加碱基的错误掺入率特异性引物： 0.10.5 umol/LDNA聚合酶： Klenow T4 、 T7聚合酶 TaqDNA聚合酶具有良好的热稳定性。并具有5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，因此可以校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。含Mg2+的缓冲液： Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为1.52.0mmol/L，过量

47、将增加非特异性条带的产生。反应分三步：1 变性 denaturation： 加热90-95，模板DNA双链解离形成单链DNA；2 退火 annealling： 温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60,Tm值4（G+C）+2（A+T）-5. 3 延伸 extension： TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。70-75 时间-要扩增片段长度决定循环次数取决于模板DNA的浓度30次扩增100万倍引物设计原则引物长度15-30bp引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象，引物G+C含量宜在45-55%左右。引物的内部不应形成二级结构，

48、两个引物间不应有互补链存在引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。计算机分析。引物3末端碱基原则上与模板配对，3末端碱基最好不是A。引物5末端碱基无严格限制，只要与模板DNA结合的引物长度足够，末端可以游离。因此可以在引物5末端加上限制性内切酶位点。 Tm = 69.3 + 0.41 (%G + C) PCR产物的检测 琼脂糖凝胶电泳；（EB）分子杂交；限制性内切酶酶切分析；微孔板夹心杂交法；直接测序反转录 PCR (RT-PCR) RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。53AAAAA535335533553RT-PCR 原理mRNA1st cDNA逆转录酶、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs5533特异 PCR