园艺植物生物技术：第七章--转基因植物课件

1、第七章 转基因植物目录转基因技术现状及其应用植物遗传转化技术载体构建遗传转化操作转基因鉴定第一节植物遗传转化现状及其应用Nature has a rich source of variation转基因技术发展1983年华盛顿大学成功将卡那霉素抗性基因导入烟草，同年4月美国威斯康星大学成功将大豆基因转入向日葵，标志着植物转基因技术的诞生。1985年，第一批抗病毒、抗虫害和抗细菌病的转基因植物进入田间试验。1986年，美国环保署允许世界第一例转基因作物抗除草剂烟草进行种植。1994年，转基因延熟保鲜番茄“FlavrSavr”获得美国食品药品管理局的批准进入市场销售，成为世界上第一个获许进行销售的转

2、基因食品。转基因植物重要里程碑1983年首例转基因植物培育成功1986年转基因植物获准进入田间试验1994年转基因番茄在美国批准上市1996年GMO面积170万ha2012年全球转基因作物种植面积170.3 million ha2012年全球转基因作物种植按作物分-2012按性状分几种作物种植GMO比例全球种GMO国家分布我国批准6个转基因作物商品化抗病毒甜椒（北京大学）耐储存番茄（华中农大）抗病毒番茄（北京大学）转CHS基因矮牵牛（北京大学）抗虫棉（中国农科院研制）抗虫棉（孟山都公司研制）转基因研究涉及的部分园艺作物番木瓜苹果柿荔枝龙眼红薯草莓梨柑橘桃番茄西瓜葡萄Pepper 花菜大白菜李马

3、铃薯Production of transgenic plants resistant to diseasesApplication 1Diseases/viral diseasesLimit productionAffect qualityInfluence growth利用植物病毒外壳蛋白基因、病毒复制酶的部分基因或反义核糖核酸抑制病毒编码的加工酶，已获得30多种抗植物病毒的转基因植物研究成果Transgenic papaya resistant to PRSVFresh papaya productiona in state of Hawaii and in Puna districtY

4、earTotalPuna (x 1,000 lb)(PRSV enters Puna) 199255,80053,010199358,20055,290199456,20055,525199541,90039,215199637,80034,195199735,70027,810(transgenic seeds released) 199835,60026,750199939,40025,610200050,25033,950200152,00040,000The yield and quality of Rainbow was exceptional, amounting annually

5、 to 125,000 L/acre vs. 5,000 L/ acre of non transgenic ones Sweet orange overexpressing PR protein from tomato: resistant to phytophthoraApple fire blightfire blight:1000ha apple were killed by FB in Michigan in 2000.Lytic protein (LP)：Royal Gala, Galaxy 和M26转avian LPs SB-37,T-4 lysozyme：Gala转harpin

6、（来于Fire blight细菌）NPR1蛋白：过量表达Silencing the DIPM kinase which is related to the occurrence of the disease.Production of transgenic plants resistant to pests and insectsApplication 2Aftermath of farm chemical我国化学杀虫剂约占农药总量的70%以上，年产量22万吨左右，30%以上用于防治棉铃虫。1992年至1996年， 24万余人农药中毒。1992年中毒人数就高达7万多人，直接经济损失达100多亿

7、元。 利用苏云金芽孢杆菌（Bt）杀虫蛋白基因CryI和CryIII，分别获得抗鳞翅目和鞘翅目害虫的转基因植物（番茄、马铃薯、烟草、杨树、水稻和棉花等）在美国，转Bt基因作物的推广减少了26.9亿美元的杀虫剂的使用1986-1998年转基因作物田间试验中，抗虫作物占29%研究成果Bt-cottonChina：1991年单价抗虫棉，1993年，开展双价抗虫棉的创新研究 2005年，国产抗虫棉已累计推广9000多万亩，创造经济效益150多亿元 ,2006年，种植2000万亩India: Bt cotton covers 8.1 m acres in 2006 每亩可减少化学农药0.5公斤，每亩增加的

8、收益约为140元 Non-Bt cottonBt cottonSource: CAAS抗虫转基因棉花获大面积推广Numbers of pesticide applications in Bt and non-Bt cotton in Hebei and Shandong in 1999- reduced by 13 applications In 2000: by 12 applications In 2001: by 14 applications Percentage (%) of poisonings reported as numbers of farmers interviewed

9、in Henan in 2000Cabbage looper粉蚊夜蛾 test Diamondback moth小菜蛾 testProduction of transgenic plants resistant to herbicideApplication 3GMO by traits-2012Transgenic soybean1994年5月美国Monsanto公司耐除草剂“镇草宁”大豆Round up Ready（农达安）。 Move to greener herbicide Benefits of Glyphosate 草甘磷Tolerance in Crops Can use at

10、any time - can wait until there is a problem Reduced herbicide use Very effective - Weeds very sensitive - GM crop very resistantGM canola surrounded by weeds- glyphosate+ glyphosateProduction of transgenic plants with altered development progressApplication 4延迟果实成熟利用反义RNA技术抑制果实软化过程中的关键酶（聚半乳糖醛酸酶或乙烯前

11、体合成酶），可使番茄果在储存期的软化延迟。1993年美国食品和药品管理局（FDA）批准上市的第一个转基因食品Calgene公司的转基因延熟番茄Flavr Savr（保味）华中农业大学园艺系叶志彪教授获得转基因番茄百日鲜（Bioscience)华番一号是我国第一个商品化生产的转基因产品对照转基因苹果乙烯生成减少的苹果转基因苹果：乙烯生成减少70%需更长时间软化硬度：高于CKSSC：高于CK比CK耐贮藏3个月后不变褐的苹果Production of transgenic plants tolerant to abiotic stressesApplication 5Approximately 70

12、% of the genetic potential yield of major crops is lost by environmental factors. (Boyer, Science, 1982, 218: 443-448)Abiotic stressEnhanced growth in transgenic aspen耐盐番茄适宜保护地栽培的或露地早春栽培；抗寒、抗盐、无限生长型单株，果高桩型；每果序4-8果、坐果率高、单果重70-100g，糖度5.0-6.0%，Vc含量为41.4mg/100g鲜重；耐贮藏、利于通风透光，适于保护地栽培，产量可达50008000kg。 将先进的抗

13、旱产品送入温室进行筛选；田间试验中领先的产品表现优异；继续评估以评价抗旱性方面的表现。CONTROL对照组WITH GENE 含基因CONTROL对照组WITH GENE 含基因孟山都与巴斯夫合作45抗旱玉米2008年农业进步展览会：含抗旱基因 对照组 转基因抗溃疡病的柑橘抗脱水的枳Production of transgenic plants with special value or traitsApplication 6Transgenic flowers with different flower color第一个转基因园艺植物是淡紫色的康乃馨Moondust：把编码类黄酮羟化酶和二氢

14、类黄酮还原酶的基因转到白色康乃馨中，在转基因植物中积累了翠雀素，使康乃馨呈淡紫色，改良作物营养品质植物类胡萝卜素代谢工程Shewmaker et al., Plant J, 1999; Lindgren et al., Plant Physiol, 2003; Paine et al., Nat Biotechnol, 2005; Rosati et al., Plant J, 2000; DAmbrosio et al., Plant Sci, 2004; Fujisawa et al., 2008; Zhu et al., PNAS, 2008; Apel and Bock, Plant

15、Physiol, 2009; Maass et al., Plos One, 2009生产特殊类胡萝卜素植物类胡萝卜素代谢工程Mann et al., Nat Biothechnol. 2000; Morris et al., Metab Eng, 2006; Jayaraj, et al., Transgenic Res, 2007; Suzuki et al., Plant Cell Rep, 2007; Zhu et al., PNAS, 2008; Fujisawa et al., J Exp Bot, 2009Golden rice-Carotene Pathway in Plant

16、sIPP异戊二烯焦磷酸GGPPPhytoeneLycopene -carotene(vitamin A precursor)Phytoene synthasePhytoene desaturaseLycopene-beta-cyclase-carotene desaturase Problem:Rice lacksthese enzymesNormalVitamin A“Deficient”RiceGA-20氧化酶部分正义抑制的苹果Reduced concentration of GA1 and GA20 in shoot tips and young leaves. The dwarf ty

17、pe can be reversed by GA3.LFY encodes a plant specific transcription factor and is considered a master regulator of floral meristem development.AP1 is a member of the MADS-box gene family of transcription factors ,which play critical roles in development processes across the plant, animal and fungal

18、 kingdoms.FLOWERING LOCUS T (FT) is one of the flowering-time genes in Arabidopsis genes and is characterized as a floral pathway integrator.Genes involved in floral developmentOverexpression of LEAFY in citrus transgenic plants.(A) Transgenic shoot grafted in vitro on a nontransgenic rootstock show

19、ing a precocious terminal flower five weeks after regeneration. (B) Transgenic plant showing a weeping growth habit. (C) Leaves from transgenic plants showing various degrees of curling (top) compared to leaves from nontransformed control plants (bottom). (D) Vegetative shoot from a transgenic plant

20、 showing the reduction of thorns and small curled leaves (right) compared to a vegetative shoot from a nontransformed control plant of the same age (left). (E) Transgenic plant flowering 16 months after its transfer to the greenhouse. (F) Ripened fruit from a transgenic plant grown in the greenhouse

21、.不引起过敏的苹果Transgenic tomato producing insulin按照植物偏爱的密码子设计并合成了人胰岛素的A链和B链的编码序列，并通过以某种方式连接成为一个ORF的人胰岛素基因（180bp） ，依据软件分析使其产物模拟天然的胰岛素结构。该基因受控于番茄果实专一性启动子，在番茄果实中高效表达。通过生吃番茄的口服途径可改善胰岛素依赖型糖尿病人自体免疫状况，达到治疗效果。亦可从番茄果实中纯化出人胰岛素，做成注射剂型。第二节 转基因技术转基因技术（Transgenic technique） 运用分子生物学技术将人工分离和修饰过的基因导入到目的生物体的基因组中，并使之整合、表达和

22、遗传，从而达到修饰原有植物遗传物质、改造不良的园艺性状、改造生物的技术。转基因技术的特点：1）突破物种界限，从DNA分子水平上有目的地、有效地改造生物。2）按照人们的意志定向的改变生物的遗传性状。3）避免在自然情况下会限制不相关品种间DNA交换的障碍4）当转入的基因整合到染色体或基因组中后，这些基因会与寄主生物的遗传物质一起向子代传递，并产生应有的生物学功能。基因工程 “Genetic engineering includes a range of techniques and methods used by scientists to control or modify genes, swi

23、tch them off or move them between two unrelated species.”一般意义上的基因工程是指“重组DNA技术”或“基因转移技术”。基因工程的四要素目的基因载体转化方法受体expressed sequenceregulatory sequencessuitable codon usage for the host or target organismprokaryote v eukaryotepost-transcriptional issuescell line v germ line transformation重组DNA筛选分离外源基因载体重组

24、转化子整合基因工程图解：转化或转染受体细胞植物基因工程 植物基因工程具有以下特点： 1）植物基因工程是在基因水平上改造植物的遗传物质，更具有科学性和精确性，同时育种速度也大大加快。 2) 植物基因工程能定向改造植物的遗传性状，提高了育种的目的性与可操作性。 3）植物基因工程大大地扩展了育种的范围，打破了物种之间的生殖隔离障碍，实现了基因在生物界的共用性，丰富了基因资源及植物品种。 植物转基因过程A.从生物有机体的基因组中，分离出带目的基因的DNA片段。B.将带目的基因的外源DNA片段，连接到能自我复制的载体分子上，形成重组DNA分子。C.将重组DNA分子转到适当的植物受体细胞内。D.筛选获得了

25、重组DNA的受体细胞，进行繁殖。E.基因的表达，产生人类所需要的物质。Plant Genetic Engineering ProcessCellExtracted DNACell divisionTransgenic plantA single geneTransformationPlant cell 植物基因工程的目的基因抗植物虫害基因（如bt基因）抗植物病毒基因（如cp基因）抗植物真菌病害基因（如几丁质酶基因）抗植物细菌病害基因（如溶菌酶基因）抗非生物胁迫基因（如耐除草剂基因）提高作物产量改良作物品质的基因（如种子贮藏蛋白基因）改良植物其他性状和雄性不育基因（如rol基因、barnase基

26、因）植物医药基因工程转化系统名称载 体转化原理转化方法受体细胞植物基因转化系统种质转化系统直接转化系统载体转化系统种质细胞茎尖细胞细胞转化法细 胞生殖细胞花粉粒卵细胞花粉管通道法浸 泡 法化学原理物理原理病毒农杆菌PEG法脂质体法激光法超声波法电泳法电激法微注射法基因枪法叶盘法原生质体共培养法共感染法DNARNARi质粒Ti质粒各种受体原生质体植物遗传转化受体类型及特性受体转化方法转化率嵌合性操作重复性愈伤组织基因枪农杆菌高较多简单组织、器官农杆菌较低有简单原生质体PEG/电击高无复杂生殖细胞花粉管通道低无简单悬浮细胞农杆菌/电击较高时有较复杂（1）高效稳定的再生能力（2）较高的遗传稳定性（3

27、）具有稳定的外植体来源（4）对选择性抗生素敏感（5）对农杆菌侵染有敏感性外植体的选择（植物基因转化受体系统应具备条件） 愈伤组织是在受伤的外植体表面产生的脱分化的无序的分生组织。胚性愈伤组织则是经由一定的组织（花药、子叶、未发育的胚珠、下胚轴等）在合适的诱导培养基上诱导分化而来，常用于根癌农杆菌介导的遗传转化，如香蕉、柑橘、葡萄、水稻、小麦、棉花等。愈伤组织受体系统特点:外植体试材广泛；扩繁量大,可获得较多的转化植株；通过体胚发生再生植株，嵌合体少；易于接受外源基因,转化率高；转化的外源基因遗传稳定性差；Fig. af Transformation of embryogenic calli o

28、f cotton and subsequent regeneration. a Embryogenic cotton calli used for transformation. b Enlarged view of embryogenic calli used for transformation. c Co-cultivated cotton calli on selection medium after 6 weeks showing a large number of globular embryo clusters. d Enlarged view of one of the glo

29、bular embryo clusters from c. e Kanamycin (Km)-resistant transformed cotyledonary embryos on embryo maturation medium. f Km-resistant plants in soil pots in the greenhousePlant Cell Rep (2004) 22:465470愈伤组织的分化 直接分化再生系统是指外植体细胞不经过脱分化产生愈伤组织阶段而直接分化出不定芽获得再生植株。 用叶片、幼茎、子叶、胚轴等为外植体,直接分化的研究已取得许多成功的实例。直接分化再生系统

30、特点:操作简单,周期短;转化的外源基因能实现稳定的遗传;更适于无性繁殖的园艺植物，如果树、花卉及 一些木本植物;转化率低于愈伤组织再生系统;嵌合体较多。D. GUS-negative citrange shoot regenerating from a GUS-positive callus.C. GFP-positive and negative shoots regenerating close from the same explants. Molecular Breeding 14: 171183, 2004.4C, Non-transformed explants regenerat

31、ed with buds and shoots formed at both ends. Annals of Botany 84: 715723, 1999外植体的分化 原生质体是“裸露”的植物细胞,它同样具有全能性,能在适当的条件下诱导出再生植株。 从70年代初首次从烟草原生质体成功的培养出再生植株以来,至今已有250多种高等植物的原生质体培养获得成功,其中包括一些重要的禾谷类粮食作物如水稻、小麦、玉米；果树类作物如柑橘、苹果等。原生质体再生系统特点:原生质体被除去了细胞壁，可直接高效的摄取外源DNA或遗传物质,甚至细胞核；嵌合体更少；易于在相对稳定和均匀的同等控制条件下进行准确的转化和鉴定

32、；适用于各种转化系统；遗传稳定性更差；周期长、难度大、再生频率低。(A) Mesophyll protoplasts isolated from GFP transgenic Valencia plant; (B) hybrid colony expressing GFP after 4 weeks culture; (C) hybrid embryoid expressing GFP after 5 weeks culture; (D) hybrid embryoid expressing GFP after 6 weeks culture. Guo WW & Grosser JW. Pla

33、nt Science 168 (2005) 15411545原生质体的转化 胚状体再生系统 植物体细胞胚胎发生是指二倍体或单倍体细胞在未经融合的情况下,模拟有性合子胚胎发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生过程。 经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体。特点:转化率和转化效率都很高；嵌合体少；胚状体具有两极性,可同时分化出芽和根；利用转基因的胚状体可生产人工种子；体细胞胚具有个体间遗传背景一致、无性系变异、小胚的结构完整、成苗快、数量大等优点,有利于转基因植株的生产和推广。 Transgenic peach plants (Prunus pe

34、rsica L.) produced by genetic transformation of embryo sections using the green fluorescent protein(GFP) as an in vivo marker. a. Regenerating buds from calli formed on an embryo section after 4 weeks in culture. b. In vitro rooted shoots. Molecular Breeding 14: 419427, 2004.胚状体 利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉

35、粒卵细胞为受体进行基因转化的系统称之为生殖细胞受体系统，也叫种质系统。 小孢子和卵细胞的单倍体培养 胚性细胞或愈伤组织细胞 单倍体植株 直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化。生殖细胞受体系统采用2-3mm厚的组织薄层（茎段）进行培养，直接诱导芽的分化，获得再生植株。在柑橘上已应用于成年态培养、遗传转化及植物激素与生长发育的关系研究领域。薄层细胞受体系统特点：试验所需要的材料少；外植体的生长与培养基的组成关系密切；通过调节培养基组成，可以从薄层切片上直接诱导芽，勿需经过愈伤阶段，遗传变异相对较少；周期短，繁殖系数大。柑橘薄细胞层培养图片引自Le Bui Van等由Tran Thanh Van

36、于1973年提出（Nature 246 (1973) 44-45）根癌农杆菌Ti质粒转化基本程序（1） Ti质粒转化载体的构建（2）受体系统的建立（3）目的基因的转化及转化子再生Agrobacterium tumefaciensTi plasmidAgrobacteriumGenomic DNAPlant cellGenomic DNA (carries the gene of interest)+Ti plasmid with the gene of interestGene of interestEmpty plasmidRestriction enzyme ARestriction en

37、zyme AAgrobacteriumTi plasmid with the new genePlant cellcells DNATransgenic plantCell divisionThe new gene+TransformationAgrobacterium tumefaciens 农杆菌介导的遗传转化农杆菌的生物学特性 农杆菌属细菌为格兰氏阴性的土壤杆菌，植物遗传工程载体主要为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogennesis)，分别通过其本身的Ti或Ri质粒完成携带基因从农杆菌到受体的转移。The

38、 Galls Can Be Huge根癌农杆菌Ti质粒的遗传特性 Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有200kb组成。 Ti质粒根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类不同可分为：冠瘿碱型(octopine)、胭脂碱型(nopaline)、农杆碱型(agropine)、农杆菌素碱型(agrocinopine)或称琥珀碱型(succinamopine)。Ti质粒结构区域（1）T-DNA区：又称转移DNA，是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。（2）Vir区：该区段的基因能激活T-DNA的转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为

39、毒区。（3）Con区：该区段上存在着与细菌间接合转移的有关基因(tra),调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，以此称之为接合转移编码区。（4）Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 Ti质粒结构示意图冠廮碱合成基因(tmt)生长素基因(tms)左边界细胞分裂素基因（tmr）右边界冠廮碱代谢基因Vir基因复制起始位点(ori) T-DNA区域 T-DNA整合机理 整合机理：T-DNA的边界序列对于信号分子的识别和T-DNA的转移是必需的，左右边界25 bp的重复序列被位点特异性的VirD蛋白所识别，该蛋白具有核酸内切酶活性，酶切并释放T-DNA单链，实现DNA的转移。 毒性

40、区基因：Vir区基因，其作用是诱导T-DNA构型的改变、转移、定位插入到核基因组中。 （1）农杆菌对受体的识别； （2）农杆菌附着到植物受体细胞； （3）诱导启动毒性区基因表达； （4）类似接合孔复合体的合成和装配； （5）T-DNA的加工和转运； （6）T-DNA的整合。 农杆菌Ti的T-DNA导入植物基因组整个过程包括：农杆菌介导转化的程序外植体的预培养农杆菌菌体的活化侵染共培养转化子的筛选培养转化植株的再生转化子的鉴定外植体预培养菌液制备侵染共培养选择培养分子鉴定田间试验遗传分析性状鉴定整合整合 外植体的预培养：一般以2-3天为宜。预培养有利于细胞分裂，从而提高外源基因的瞬时表达和转化率

41、；驯化作用；减少杂菌污染率；利于外植体与培养基的平整接触。 外植体的农杆菌接种：菌液浓度一般为OD600=0.5-0.7之间；浸泡后的外植体要在无菌滤纸上吸干，以除去过量的菌体。 农杆菌与外植体共培养：在固体培养基表面加一层滤纸，有利于控制外植体上农杆菌过度增殖。共培养时间必须长于16h，一般为2-3天。在共培养培养基中加入As(乙酰丁香酮，细胞创伤诱导分子)或采用tomato feeder plates均可提高转化率。 外植体脱菌及选择培养：常用的脱菌抗生素有羧苄青霉素（carbenicillin）、头孢霉素（cefotaxine）及羧噻吩青霉素（timentin）。常用的选择抗生素如Km、

42、HPT、bar等。转化植株的再生转化株的分子鉴定（PCR、Southern blot、Northern blot、Western blot、实时定量PCR）转化株的形态、性状观察（株形、分枝、开花结果习性等）转化株后代遗传分析根癌农杆菌Ti质粒转化的方法整体植株接种共感染法叶盘转化法原生质体共培养转化法农杆菌介导转化的优缺点 优点：成功率高，效果好；转移的外源基因常为单拷贝整合，很少会发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且多数符合孟德尔遗传规律；费用低，方法简单易操作；寄主范围广，几乎所有的双子叶植物都可采用此法，尤其近年来在一些单子叶植物上也取得成功（已有7个科的20多种单子叶植物转化获得成

43、功）。 不足之处： 农杆菌介导的转化主要应用于双子叶植物，还有少数的单子叶植物；而大多数单子叶植物，尤其是禾本科作物对农杆菌不敏感，限制了它的应用；另外，农杆菌侵染后的外植体再生阶段脱菌比较困难，需要长期使用抗生素，给实验带来烦恼。 PEG介导基因转化 PEG介导基因转化是Davey等（1980）和Krens等（1985）首先建立。 PEG法的主要原理是化合物聚乙二醇、多聚L-鸟氨酸（pLO)、磷酸钙及高PH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。PEG介导基因转化法步骤（1）Ti质粒DNA提取（2）原生质体分离（3）转化培养（4）转化培养同时加入运载DNA（即鲑鱼精DNA或小牛胸腺DNA）（

44、5）离心收集原生质体或用钙离子溶液使PEG逐步稀释（6）将原生质体培养于选择培养基上或不加选择压力按一般方法培养（7）当细胞团长到一定大小时将细胞团转移至含选择压力的培养基中筛选转化细胞PEG法的特点避免嵌合转化体的产生；对细胞伤害少，而且转化顺利；其转化的原生质体易于选择转化体；原生质体转化是理论研究的极好的实验系统；受体植物不受种类的限制。 PEG法不足之处建立原生质体再生系统十分困难，从而阻碍了PEG法的应用；转化率低；从原生质体再生的无性系植株变异较大，因此通过PEG法转化后的转基因植株将产生更多的无性系变异。 电击法介导基因转化 电击法是利用高压电脉冲作用在原生质体膜上“电击穿孔”（

45、electroporation),形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。 此法在动物细胞中应用较早并取得很好效果，李宝健等于1985年首次将其应用于植物细胞的基因转化。 电击法介导基因转化步骤（1）分离原生质体加入电击缓冲液重悬，并离心3分钟去掉上清液，再加入适量的电击缓冲液，计数，将原生质体密度调节到1106 2106个/ml（2）加入10g/ml质粒DNA和50g/ml鲑鱼精子DNA，混合后分装于电击反应槽内（3）冰浴5min（4）选择不同参数电击（5）600r/min离心3min除去电击缓冲液，用液体培养基洗涤（6）将原生质体包埋于固体培养基中，28黑暗条件下选择培养 电击法特点

46、 电击法除了同样具有PEG原生质体转化的优点外，还具有操作简便，DNA转化效率较高，特别适于瞬时表达的研究。缺点是造成原生质体的损伤，使植板率降低，且仪器也较昂贵。 基因枪法介导基因转化 基因枪法（particle gun)又称微弹轰击法（microprojectile or biolistic bombardment)。最早是由美国康奈尔（Cornell)大学的Sanford等（1987）研制出火药引爆的基因枪。 其基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得以表达，从而实现基因转化。B

47、iolistics Gun “Gene Gun” TechniqueDNA coated golden particlesGene gunCell divisionA plant cell withthe new geneTransgenic plantPlant cellCells DNA基因枪法的特点 优点：无宿主限制靶受体类型广泛可控度高操作简便快速，甚至可以克服无菌的困难缺点及存在问题：基因枪的硬件设计尚待改善微弹的表面结构、大小、均一性及承载DNA的量及DNA微粒载体的制备技术等特定物种、特定组织、细胞的轰击条件如何诱导更多的细胞同时成为转化和再生感受态是一个非常重要的问题轰击后进入

48、受体细胞的DNA生物学变化及调控等理论问题 花粉管通道法介导基因转化 是由周光宇等（1983）年建立发展起来的 原理：借助植物自身的生殖细胞（卵细胞或受精卵）为转化对象的直接转化技术，外源基因或DNA可以通过花粉管通道进入受精胚囊，因而称为花粉管通道法（途径）。 使用范围：开花植物 优点： 利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需人工培养过程；方法简便，一般常规育种者易于掌握，成本低，适于普及和使用；单子叶、双子叶植物均可使用，育种时间短。 缺点： 这一技术局限于开花时间才能应用；必须有遗传育种和分子遗传学、分子生物学方面的基础知识，才能恰当的进行DNA供受体的组合和判断DNA

49、导入的结果，达到分子育种的目的；应用总DNA片段的导入，筛选到的子代可能带有目的性状基因以外的DNA片段。常用基因转化方法特点比较转化方法农杆菌法PEG法电击法微针注射法基因枪法受体材料完整细胞原生质体原生质体原生质体完整细胞宿主范围 有无无无无组培条件简单复杂复杂复杂简单嵌合体比例有无无无多操作复杂性简单简单复杂复杂复杂设备要求便宜便宜昂贵昂贵昂贵工作效率高低低低高单子叶植物应用少可行可行可行广泛农杆菌的活化挑单克隆测OD600收集细胞用液体MS培养基重悬细胞将预培养的外植体放入菌液中共培养100rpm,30min取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液共培养在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成

50、转化芽诱导芽生长生根，形成转化植株Plant Tissue CultureA Requirement for Transgenic DevelopmentA plant part Is culturedCallusgrowsShootsdevelopShoots are rooted;plant grows to maturity第五节转基因鉴定转基因植物的检测鉴定外源基因是否进入植物细胞？进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上？整合的方式如何？整合到染色体上的外源基因是否表达？转基因植物的检测鉴定方法报告基因/标记基因的检测转基因植物的PCR检测外源基因整合的Southern杂交鉴定外

51、源基因转录的Northern杂交检测外源基因表达蛋白的检测生物学鉴定报告基因的检测报告基因是明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，又称选择标记基因。常用的报告基因NPT-II 新霉素磷酸转移酶基因 抗氨基环醇类抗生素CAT 氯霉素乙酰转移酶基因 抗氯霉素HPT 潮霉素磷酸转移酶基因 抗潮霉素GUS -葡萄糖苷酸酶基因 产生蓝色物质GFP 绿色荧光蛋白基因 产生绿色荧光LUC 荧光酶素基因 发射光子NPT- 活性检测目的 ：检测Npt-基因在植物组织中的表达原理： NPT-使ATP分子上的-P转移到抗生素分子上，影响抗生素与核糖体的结合，从而使抗生素失活。检测时使用放射性标记的-32P ATP，

52、通过-磷酸基团转移，生成放射性的卡那霉素来检测。检测方法：点渍法，层析法，凝胶原位检测法NPT- 提取物 + -32P ATP 32P磷酸化的卡那霉素放射自显影cat基因活性检测原理： 氯霉素能与原核细胞50S亚基或真核细胞线粒体核糖体大亚基结合，抑制蛋白质生物合成。cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，该酶催化酰基由乙酰CoA转向氯霉素，可生成1-乙酰氯霉素、3-乙酰氯霉素、1,3-二乙酰氯霉素三种乙酰化产物。乙酰化了的氯霉素不再具有氯霉素活性，失去了干扰蛋白质合成的作用。cat基因活性可以通过反应底物乙酰CoA的减少或反应产物乙酰化氯霉素的生成来测定，常用的方法有硅胶G薄层层析法及DTNB分光光

53、度法。gus基因的检测gus基因编码 -葡萄糖苷酸酶基因，该酶是一种水解酶，能催化许多-葡萄糖苷酯类物质的水解。检测常用底物有3种： 5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖苷酸酯（X-Gluc） 4-甲基伞形酮酰- -D-葡萄糖醛酸苷酯（4-MUG） 对硝基苯-D-葡萄糖醛酸苷（PNPG）检测方法：组织化学染色定位法X-Gluc 荧光法测定GUS活性4-MUG 分光光度法测定GUS活性PNPG组织化学染色定位法检测GUS以X-gluc为底物，在适宜条件下该酶将底物水解成蓝色物质，GUSGUS used for promoter analysisgfp基因的检测绿色荧光蛋白是一些腔肠动物所特有的生

54、物荧光素蛋白。生物荧光素蛋白是指存在于生物体内，能在激发光作用下发射出荧光的蛋白质。它可与目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因表达情况。检测方法：对于转化细胞可用蓝光照射，在显微镜下分拣发出强烈绿色荧光的细胞。对于转化植株，可在激发光照射下利用解剖照相系统进行绿色荧光蛋白检测和定位。GFP used forsubcellular localization OSPK1蛋白的亚细胞定位 制备水稻原生质将pUC-OSPK1-GFP质粒转入原生质体中。同时也将质粒pUC-GFP转入原生质体中作为对照 培养原生质体 用共聚焦荧光显微镜观察，并照相 不含有OSPK1基因的原生体pUC-GFP

55、 含有OSPK1基因的原生体pUC-OSPK1-GFP 转化对照质粒的原生质体整个细胞有绿色荧光，而转化含有OSPK1基因质粒的原生质体的绿色荧光则主要在细胞的质膜上 GFP在水稻原生质体中的瞬时表达结果 35S OSPK1 GFP NOS野生型GFP发射的荧光强度较弱，因此利用突变来寻找强荧光型GFP基因。GFP肽链中组成发色团的氨基酸残基发生突变会引起荧光强度的改变。GFPS65T：Ser65变为Thr，在转化的细胞中荧光活性比野生型强18倍。萤火虫荧光素酶基因的检测荧光素酶可以催化生物体自身发光，现在研究较多的是荧火虫荧光素酶及细菌产生的荧光素酶。萤火虫荧光素酶催化的底物是6-羟基喹啉类，脱羧后生成激活态的氧化萤光素；细菌萤光素酶以脂肪醛为底物，氧化成为脂肪酸。检测方法：取被检材料置小容器内，加入适量的组织培养液体培养基、ATP、萤光素，置暗室中放置，用肉眼观察荧光。或盖以X-光片，观察曝光情况，产生曝光点的样品是转基因成功的。萤光素酶基因是一个灵敏的报告基因,检测的灵敏度比CAT高100倍,而且没有背景，萤光素酶基因的最大特点是不损害植物,即在整体植物或离体器官内,基因产物都可测定，但萤光素酶基因产物易在过氧化物酶体中积累,在植物体内产生光的部位不一定能反映萤光素酶基因的特定表达部位。Activity 转基因植物的PCR检测PCR是在体外快速特异地扩增目的