医学NK细胞毒活性ppt培训课件

1、NK细胞毒活性实验分组及材料实验原理检测方法主要操作步骤结果判定 主 要 内 容2器材75%酒精 若干无菌纱网 1块/组无菌平皿 1块/组无菌吸头（大、中、小）3盒/room无菌96孔培养板 1块/组可调微量加样器 1套/组细胞计数板 1套/组显微镜 1台/组EP管 若干眼科剪、小镊子 1套/ 组细胞培养箱 1台/room酶标仪 1台离心机 2个/room超净台 1台/组动物、细胞及试剂小鼠 1只/组(NS,OVA)YAC-1 1*106 * 2ml 培养液（DMEM) 无FCS 4ml/ 组培养液(DMEM)10%FCS 10ml/组LDH底物 3ml/组柠檬酸（终止液） 1ml/组分组：

2、每组4人 1只小鼠实验分组及材料3 NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。 NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 原 理4密度梯度离心Ficoll 密度梯度离心Percoll密度梯度离心磁化细胞分离器分离法 NK细胞分离方法5同位素释放法：51Cr、3H-TdR、125I-UdR 乳酸脱氢酶释放法 (

3、本次实验采用) 常用的检测方法6G0G1SNa251CrO4、 3H-TdR、125I-UdR New DNAOr Proteincpm同位素释放法7应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞，当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏，释放出51Cr。51Cr辐射射线，通过测定受损伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。同位素释放法8乳酸脱氢酶(LDH)存在于细胞内，正常情况下，不能透过细胞膜。当细胞受到损伤时，LDH可从细胞内释放至培养液中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶I(NAD+)变成还原型辅酶(NADH)，后者再通过

4、递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)还原碘硝基氯化氮唑蓝(INT)或硝基氯化四氮唑蓝(NBT)形成有色的甲基化合物，在570nm波长处有一吸收峰，利用读取的值，可测得杀伤细胞毒活性。 乳酸脱氢酶释放法-原理9靶细胞YAC-1NK杀伤LDH释放到细胞外无色底物LDH底物还原有色物质测OD570值 乳酸脱氢酶释放法靶细胞膜损伤最大释放均值（Max）=最大释放孔cpm均值-最大释放对照孔cpm均值自发释放均值（S自发）=自发释放孔cpm均值-培养基对照孔cpm均值 杀伤率( %)=Max- S自发实验值-自发释放值 10010操作流程 1W无菌取脾研磨成单细胞悬液+2ml 1640（无FBS)细胞计数

5、 【?/ml】取20ul细胞+980ul的1640混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝加板(三复孔)(加法见附图)调细胞浓度1107 /ml5%CO2 37培养2小时离心，取100ul上清移入新孔， 37孵育10min加入底物 100ul/well 室温避光孵育15min 30l /孔 1mol/L柠檬酸 酶标仪测吸光度值：OD570nm结果判定：培养YAC1细胞10%FBS1640培养液调细胞浓度1106/ml11单细胞悬液的制备小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组

6、织，将其捣碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。细胞计数：取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。调脾细胞浓度至1107/ml，每组所需总量为1ml调YAC1细胞浓度至1106/ml，每组需2ml注意:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时

7、间沉淀使细胞数不准。实验步骤 12细胞培养：按图所示加板。将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37 5%CO2培养箱中，培养2小时。LDH底物：在培养2小后，1000rpm，离心5min，取100ul上清液移入新孔内，于每孔内加入LDH底物 100ul，加完后轻轻搕板，使之混匀。室温避光保存15min。 取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。结果测定：结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。结果判定：Max （ 靶细胞最大释放）=最大释放孔均值-最大释放对照孔均值S自发 （靶细胞自发释放） =自发释放孔均值-培养基对照孔均值注： S

8、自发 0，做“0”处理 实 验 步 骤 SI=Max- S自发实验孔值-自然释放孔值100%131-34-67-910-12A自然释放孔100ul YAC-1 cells+100ul 10% 1640B(E:T=100:1） 100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen CellsC(E:T=50:1）100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells +50ul 10%1640D(E:T=25:1）100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells +75ul 10%1640E最大释放孔100ul YAC-1 cells+100ul 1% NP-40F最大释放对照孔100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640G培养基对照孔200ul 10% 1640Max=E-F S自发=A-G 加 板 方 法Max- S自发 B,C,D A 实验孔值-自然释放孔值1