兽医实验室诊断技术培训教材(共27页)

1、兽医(shuy)实验室诊断技术暨生物安全(nqun)管理培训班教程吕梁市动物(dngw)疫病预防控制中心二一年六月目 录一动物疫病诊断(zhndun)技术1、口蹄疫正向间接血凝试验(shyn)操作规程2、禽流感血凝抑制(yzh)试验3、新城疫血凝抑制试验4、猪瘟正向间接血凝试验操作规程5、布氏杆菌凝集试验6、ELISA检测方法二、兽医实验室仪器操作规程三、兽医实验室生物安全管理四、兽医实验室检测质量控制五、兽医实验室管理制度第一部分 动物(dngw)疫病诊断技术口蹄疫正向(zhn xin)间接血凝试验操作规程一、原理(yunl) 用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，亦称

2、间接血凝。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下形成抗原抗体复合物。但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。将抗原吸附（致敏）在红血球表面，再与抗体结合，红血球便出现凝集现象，不仅肉眼能看见，而且反应的敏感性大大提高。本法就是将口蹄疫纯化病毒致敏到绵羊红血球表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测动物血清中的口蹄疫抗体水平。 二、适用范围 主要(zhyo)用于检测口蹄疫疫苗接种动物血清抗体效价。 三、试验(shyn)器材 1、 96孔110120度V型医用血凝板，与血凝板大小(dxio)相同的玻板。 2、 微量移液器与吸头。 3、 口蹄疫血凝抗原（口蹄疫正向血凝诊断液）。 4、 口蹄疫阴性血清。 5、

3、 口蹄疫阳性血清。 6、 稀释液 7、 待检血清（被检血清） 四、试验方法 1、加稀释液 在血凝板上16排的19孔；第7排的14孔，第67孔；第8排的112孔各加稀释液50微升。 2、稀释待检血清 取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，混匀（避免产生过多的气泡），取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔直到第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排19孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2,1:4,1:8,1:16,1;32,1:64,1:128,1:256,1:512。 取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换(gnhu

4、n)吸头一个。 3、稀释阴性(ynxng)对照血清 在血凝板上的第7排第1孔加阴性血清50微升，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时(c sh)阴性血清对照孔依次为：1:2,1:4,1:8,1:16。第67孔为稀释液对照。4、稀释阳性对照血清 在血凝板上的第8排第1孔加入阳性血清50微升，对倍稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃，此时阳性血清稀释倍数为1:21:4096。 5、加血凝抗原 被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25微升（充分摇匀，瓶底应无稀释液对照）。 6、振荡混匀 将血凝板置于微量振荡器上振荡1分钟，如无振荡器，用

5、手摇匀亦可。然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，室温下静置1.52小时判定结果，也可延至翌日判定。 7、 判定标准 移去玻板，将血凝板放在白纸(bi zh)上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，应无凝集，或仅出现“+”凝集。 阳性血清对照1:21:256各孔应出现(chxin)“+”凝集为合格。 在对照孔合格的前提下，再观察(gunch)待检血清各孔，以呈现“+”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清15孔呈现“+”凝集，67孔呈现“+”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:12

6、8。 接种O型口蹄疫灭活苗的猪群血清O型抗体效价达到1:128（或1:128以上）为免疫合格。 五、注意事项 1、 为使您的检测获得正确结果，请您在检测前仔细阅读试剂盒内的说明书。 2、 严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。 3、 勿使用90度和130度血凝板，以免误判结果。 4、 用过的血凝板应及时在水龙头下冲净血球，再用蒸馏水或去离子水冲洗2次，甩干水份放37恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，37干燥备用。 5、 每次检测(jin c)只做一份阴性、阳性和稀释液对照。禽流感血凝抑制(yzh)试验（HI）一、原理(yunl)禽流感病毒在适宜的条件下对鸡、人、豚鼠的

7、红细胞具有凝集作用，这种血凝作用可被特异性抗体所抑制，抗体与病毒结合后，可使血凝素不能吸附于红细胞表面的受体上，禽流感血凝抑制试验可应用标准病毒液测定血清中的相应抗体，也可应用特异性抗体鉴定新分离的病毒。 二、试剂(shj)与材料 1器材：96孔V型微量血凝反应板；单、多道微量移液器；滴头；微量振荡器；普通天平(tinpng)；分析天平；普通离心机；高压灭菌器。 2试剂(shj) 2.1禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型阳性血清。 2.2 1%鸡红细胞悬液（RBC） 2.3 PH7.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS） 三、操作步骤 3.1微量血凝试验（HA） 于V微量血凝反应板的每孔中

8、滴加PBS25ul，共滴四排。 吸取病毒抗原滴加于第一列孔，每孔25ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取25ul弃之。 于每孔中再加入PBS25ul。 于每孔中加入1%鸡红细胞悬液25ul。 置微型振荡器上振荡混匀，室温（约20）静置40分钟，或460分钟，应在对照孔的RBC显著呈钮扣状时判定结果。 以红细胞完全凝集（+）的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，表示一个HA单位（HAU）。每次四排重复，以几何均值表示结果。 计算(j sun)出含4个血凝单位的抗原浓度，按如下公式进行计算： 抗原(kngyun)应稀释倍数=血凝滴度/4 3.2 微量血凝抑制(yzh)试验

9、（HI） 于微量血凝反应板111孔中加入25ulPBS，第12孔加入50ulPBS。 吸被检血清25ul于第1孔中，混匀后吸于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，最后弃去25ul。 1-11孔均加入含4个HAU的病毒抗原液，室温下静置不少于30分钟，4不少于60分钟。 滴加25ul1%红细胞悬液与各孔中，振荡混合后，室温下静置40min,或460分钟，应在对照孔的RBC显著呈钮扣状时判定结果。 四、结果判定 完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为HI效价。 阴性对照血清效价不高于2log2,和阳性对照血清效价应在已知效价的一个稀释度以内，结果有效。HI效价小于或等于3log2判定HI试验阴性；H

10、I效价等于4log2为可疑，需重复试验，HI效价大于或等于5log2为阳性。五、注意 在该试验中，鸡血清极少出现非特异性阳性反应，没有必要(byo)在试验前对血清进行处理，除鸡外有些禽的血清可能对鸡红细胞产生非特异性凝集素，每0.5ml血清中加入0.025ml鸡红细胞，轻摇后静置至少30分钟，800转离心25分钟，小心移去吸附的血清。新城疫红细胞血凝抑制(yzh)试验1、 仪器设备： a. 微量血凝板：V型、96孔;b. 微型(wixng)振荡器； c. 塑料采血管；d. 微量可调移液器：50L 2 、试剂 2.1 稀释液 PH7.07.2磷酸缓冲盐水 氯化钠(GB16677) 170g 磷酸

11、二氢钾(GB127477) 13.6g 氢氧化钠(GB62977) 3.0g 蒸馏水 1000mL 高压(goy)灭菌，4保存(bocn)，使用时作20倍稀释 2.2 浓缩抗原 2.3 0.5%红细胞悬液 采成年鸡血，用20倍量磷酸缓冲盐水洗涤34次，每次以2000r/min离心34min，最后一次5min，用磷酸缓冲盐水配成0.5%悬液。 2.4 标准阳性血清 3、 被检血清 每群鸡随机采血2030份血样，分离血清。 采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至68cm长。将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5min，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。若

12、需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0保存。 4、 操作方法 4.1 微量血凝试验 4.1.1 于微量血凝板(1.1)的每孔中滴加稀释液(2.1)50L，共滴四排。 4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50L，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11列孔各吸取50L弃之。最后一列不加抗原作对照。 4.1.3 于每孔中加入0.5%红细胞悬液(2.3)50L。 4.1.4 置微型振荡器(1.2)上振荡1min，或手持血凝板绕圆圈混匀。 4.1.5 放室温下(1820)3040min，根据血凝图象判定结果。 以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝

13、滴度。每次四排重复，以几何均值表示结果。 4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度。按以下公式进行计算： 抗原应稀释倍数=血凝滴度/4 4.2 微量血凝抑制试验 4.2.1 先取稀释液(2.1)50L，加入微量血凝板(1.1)的第1孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入312孔，每孔50L，第2孔加浓度为8个血凝单位的抗原50L。 4.2.2 吸被检血清(3)50L于第1孔（血清对照）中，挤压混匀后吸50L于第2孔，依次倍比稀释至第12孔，最后弃去50L。 4.2.3 置室温(1820)不作用20min. 4.2.4 滴加50L0.5%红细胞悬液(2.3)于各孔中，振荡混合后，室温下静置3

14、040min，判定结果。 4.2.5 每次测定应设已知滴度的标准阳性血清(2.4)对照。 5 结果判定 5.1 在对照出现正确结果的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度。 5.2 若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度，说明鸡群已受新城强毒感染。 5.3若监测鸡群的免疫水平，则血凝抑制滴度在4(log2)的鸡群保护率为50%左右；在4(log2)以上的保护率达90%100%；在以4(log2)下的非免疫鸡群保护率约为9%，免疫过的鸡群约为43%。鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示，如平均水平在4(log2)以上，表示该鸡群为

15、免疫鸡群。 6 影响血凝抑制试验的因素 6.1 稀释液 最常用的稀释液为生理盐水，要求其无菌、无杂质。试验前要先调整其pH为7.0。若稀释液生理偏酸性，易使红细胞溶解；偏碱时，吸附于红细胞上的病毒易脱落。 6.2 红细胞的配制 针管内加3.8的枸椽酸钠抗凝，从翅静脉（或心脏）采集成年健康未免疫的公鸡血，配平，以2 000 rmin离心5 min，3次，生理盐水洗涤3次，吸去上清液和白细胞层，配成1红细胞悬液，4冰箱中可保存3天，时间再长会发生溶血，最好现配现用，使结果出现的快且明显。 6.3 4单位抗原的配制 用血凝试验测出标准抗原的血凝价，倒退2孔，为此病毒的4单位抗原。抗原要小量分装，免反

16、复冻融引起效价下降，每隔3周测定一次抗原效价。4单位抗原要现配现用，并设置对照。 6.4 反应板 最好用96孔V型板，切记不可用试管刷刷板，以免破坏孔内壁的光滑性。板必须刷净，不干净会出现自凝现象。试验完毕后，用自来水反复冲洗反应板，浸在2盐酸溶液中过夜，再用自来水冲洗，浸入1氢氧化钠中15min后，拿出用自来水冲洗，最后浸泡于蒸馏水中30min以上，捞出将孔内水甩净，倒放于37恒温箱中烘干备用。 6.5 被检血清 采血时，要一鸡一针一管，血清新鲜无杂质，无溶血。 6.6 其它因素 要求技术人员态度认真，技术熟练，在对被检血清进行倍比稀释时，定量移液器要插入液面以下，出现气泡，会影响结果。加4

17、单位病毒和1红细胞悬液时滴头要离开液面，最好从后往前加。此外，检查定量移液器刻度是否精确；做一个血样换一个吸头；恒温箱温度要准确等等。 综上所述，在进行HI试验的过程中，应根据实际情况，尽量消除不利因素，减少误差。猪瘟(zh wn)间接血凝操作方法一、 试验(shyn)材料1、 6孔110-120微量血凝板。2、 10-100微升可调微量移液器3、 吸头(tip头)4、 猪瘟间接血凝抗原(kngyun)（猪瘟正向血凝诊断液），每瓶5毫升，可检测血清25-30头份。5、 阳性(yngxng)对照血清，每瓶2毫升；阴性对照血清每瓶2毫升6、 稀释液每瓶10毫升(ho shn)7、 待检血清(xuq

18、ng)每份0.2-0.5毫升（56水浴灭活30分钟）二、 操作步骤1、 检测前，应将冻干诊断液每瓶加稀释液5毫升浸泡7-10天后方可应用。2、 稀释待检血清：在血凝板上的第一孔第六孔各加稀释液50ul加入第一孔，混匀后从中取出50ul加入第二孔，依此类推直至第六孔混匀后丢弃50ul，从第一孔第六孔的血清稀释度依次为1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64。3、 稀释阴性血清和阳性血清：在血凝板上的第11排第1孔加稀释液60ul，取阴性血清20ul混匀后取出30ul丢弃。此孔即为阴性血清对照孔。在血凝板上的第12排第1孔加稀释液70ul，第2孔第7孔各加稀释液50ul 。吸取阳性血清

19、10ul，加入第1孔混匀并从中取出50ul加入第2孔直到第7孔混匀并丢弃50ul。该孔的阳性血清稀释度则为1：512。4、 在血凝板上的第1排第8孔加稀释液50ul即为稀释液对照(duzho)孔。5、 滴加抗原：第1排18孔和对照孔各加血凝抗原25ul立即置微量震荡(zhndng)器上震荡1分钟，或用手摇匀。室温下静置1.5-2小时。6、 判定方法和标准(biozhn)：先观察阴性血清对照好和稀释液对照孔，红血球应全部沉入孔底，无凝集现象（）或呈阳性（+）的轻度凝集为合格；阳性血清对照应呈(+)凝集为合格。在以上3孔对照合格的情况下，观察待检血清各孔的凝集程度，以呈“+”凝集的待检血清最大稀释

20、度为血凝效价（血凝价）。血清的血凝价达到1：16为免疫合格。“”表示红血球100沉于孔底，完全不凝集“+”表示约有25的红血球发生凝集“+”表示50红血球出现凝集“+”表示75红血球凝集“+”表示90-100红血球凝集7、 注意事项（1） 勿用90或130血凝板，以免(ymin)误判。（2） 污染严重或溶血(rn xu)严重的血清样品不宜检测。（3） 冻干血凝抗原，必须加稀释液浸泡710天，方可使用，否则(fuz)易发生自凝现象。（4） 用过的血凝板，应及时冲洗干净，勿用毛刷或其它硬物刷洗板孔，以免影响孔内光洁度。（5） 使用血凝抗原时，必须充分摇匀，瓶底应无血球沉积。（6） 液体血凝抗原4-

21、8贮存，有效期三年。（7） 如来不及判定结果或静置2小时结果不清晰，也可放置第二天判定。（8） 每次检测，只设阴性、阳性血清和稀释液对照各1孔。（9） 稀释不同的试验要素时，必须更换塑料咀。（10） 血凝板和塑料咀洗净后，自然干燥，可重复使用。 布氏杆菌血清学诊断(zhndun) 应用血清(xuqng)学方法检出血清中有抗体存在，则说明被检动物为布氏杆菌病患畜。动物感染布氏杆菌以后首先出现的是凝集抗体，再过一段时间才出现补体结合抗体，最后产生变态反应性。补体结合反应是一种高度特异性的，其阳性反应与感染的符合率，比血清凝集试验与感染的符合率高。此种方法用来鉴别注苗后和自然感染所引起的血清学反应很

22、有价值，如48个月犊牛注射19号菌苗、和山羊注射Revl号菌苗，经过6个月后补体结合反应为阴性，而血清凝集反应仍为阳性或可疑。 我国的家畜布氏杆菌病检疫应用的免疫生物学方法(fngf)主要是凝集试验，补体结合试验及变态反应试验。 1试管凝集反应；本试验按家畜布氏杆菌病试管凝集反应技术操作规程及判定标准进行。 (1)材料准备： 抗原：由兽医生物药品厂生产供应。使用时用0.5石炭酸生理盐水作1：20稀释，长霉或出现凝集块的抗原不能应用。被检血清：必须新鲜，无明显蛋白凝固，无溶血现象和腐败气味。阳性血清和阴性血清：由兽医(shuy)生物药品厂生产供应。稀释液：0.5石炭酸生理盐水，用化学纯石炭酸与氯

23、化钠配制，经高压(goy)灭菌后备用。检疫羊用稀释液用0.5石炭酸10氯化钠溶液。 (2)操作步骤： 被检血清稀释度：一般情况，牛、马和骆驼用1：50、1：100、1：200和1：400四个稀释度；猪、山羊、绵羊(minyng)和狗用1：25、1：50、1：100和1：200四个稀释度。大规模检疫时也可用两个稀释度，即牛、马和骆驼用1：50和1：100；猪、羊、狗用1；25和1：50。 稀释血清和加入抗原的方法：以羊、猪为例的是：，每份被检血清用5支小试管(810m1)，第1管加入稀释液23ml，第2管不加，第3、4和第5管各加入05ml，用lml吸管取被检血清02ml，加入第1管中，混匀(一

24、般吸吹34次)吸取混合液分别加入第2管和第3管各05ml，将第3管混匀，吸05ml加入第4管，第4管混匀吸取05ml加入第 5管，第5管混匀后弃去05ml。如此稀释后从第2管起血清稀释度分别为l：12.5、1：25、1：50和1：100。然后将1：20稀释的抗原由第2管起，每管加入05ml，血清最后稀释度由第2管起依次为1：25、1：50、1：100和1；200。 试管凝集试验也可用简便方式进行(jnxng)，即以02ml吸管将被检血清以0.08、0.04、0.02及0.01分别加入4支小试管内，然后每管加入1：40稀释的抗原lml，充分摇匀，这样4管血清的最后稀释度分别为1：25、1：50、

25、1：100、1：200。 牛、马和骆驼的血清稀释和加抗原的方法(fngf)与前述者一致，不同的仅第1管加稀释液 2.4ml及被检血清0.1ml。加抗原后从第2管到第5管血清稀释度依次为l：50、1：100、1：200和1：400。每次试验须作三种对照，阴性血清对照须将血清稀释到其原有滴度，其他(qt)步骤同上。抗原对照即将当时使用的乙稀释抗原0.5ml加稀释液0.5m1。 每次试验须制备比浊管，以为记录结果的依据，配制方法即以当时使用的已稀释抗原加等量稀释液，按表11比例配制。表1l 比浊管配制方法管 号抗原稀释液(m1)试验用稀释液(m1)清 亮 度()标 记1234500025050751

26、0007505025001007550250+-全部(qunb)试管充分振荡后，置3738温箱中，2224h后用比浊管对照检查记录(jl)结果。出 现50以上凝集的最高稀释度就是这份血清的凝集价，因此50亮度的比浊管很重要。 (3)结果判定：牛、马和骆驼血清凝集价为l：100以上(yshng)，猪、羊和狗1：50以上者，判为阳性。牛、马和骆驼血清凝集价为1：50，猪、羊和狗为1：25者判为可疑，可疑反应的家畜经34周重检，牛、羊重检时仍为可疑，判为阳性。猪和马重检时仍为可疑，但农场中未出现阳性反应及无临诊症状的家畜，判为阴性； 鉴于猪血清常有个别出现非特异性凝集反应，在试验时须结合流行病学判定

27、结果。如果出现个别弱阳性(例如凝集价为1：1001：200)，但猪群中均无临诊症状(流产、关节炎、睾丸炎)，可以考虑此种反应为非特异性，经34周可采血重检。2平板凝集反应(fnyng)：这种试验反应按家畜布氏杆菌病平板凝集反应技术操作规程及判定标准进行。(1)操作步骤 最好用平板凝集试验箱。无此设备可用清洁玻璃板，划成4cm2方格，横排5格，纵排可以数列(shli)，每一横排第一格写血清号码，用02ml吸管将血清以0.08、0.04、 0.02、0.01ml分别依次加于每排4小方格内，吸管须稍倾斜并接触玻璃板，然后以抗原滴智垂直于每格血清上滴加1滴平板抗原(1滴等于0.03ml，如为自制滴管，

28、须事先测定准确)，或用0.2ml吸管每格加0.03ml。肿牙签或细金属棒将血清抗原混合，均匀。一份血清用一根牙签，以0.01、0.02、0.03和0.04的顺序混合。混合完毕将玻板均匀加温约300C左右(无凝集反应箱可使用灯泡或酒精火焰)，58min按下列(xili)标准记录反应结果： +：出现大凝集片或小粒状物，液体完全透明，即100凝集。 +：有明显凝集片和颗粒，液体几乎完全透明，即75凝集。 +：有可见凝集片和颗粒，液体不甚透明，即50凝集。 ：仅仅可以看见颗粒，液体浑浊，即25凝集。 一：液体均匀浑浊，无凝集现象。平板凝集反应的血清量0.08、0.04、0.02和0.01ml加入(jir)抗原后，其效价相当于