His标签融合蛋白纯化常见问题解析

1、纯化原理His标签融合蛋白的纯化是借助于层析介质上的过渡金属离子（如Cu2+、 Zn2+、Ni2+、Co2+等）与His融合蛋白上的His标签的配位作用实现目标蛋白的 分离。组氨酸（His）的残基上带有1个咪唑基团，可以和Ni2+等过渡金属离子形 成配位键而选择性的结合在金属离子上，这些金属离子通过螯合配体固定在层析 介质上，因此带有His标签的蛋白可以特异性的吸附在螯合了 Ni2+等过渡金属离 子的层析介质上，而其他不含His标签的杂质蛋白则不能吸附或仅微弱吸附在介 质上。通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱，可以将His标签融合蛋白 从层析介质上解吸附下来，从而得到较高纯度的目标蛋白。

2、His标签蛋白纯化策略His标签蛋白纯化的所有优化策略都是基于改变标签蛋白和过渡金属离子之 间配位作用力的强弱，而影响配位作用力强弱的因素如下：2.1标签长度及暴露程度最常用的His标签是6个重复的组氨酸，但在实际操作过程中，可控制在 4-10个组氨酸的标签长度。标签越长，蛋白与过渡金属离子的结合力越强。过渡金属离子只能与蛋白表面的组氨酸集合，所以His标签暴露的程度越 高，结合能力越强。2.2过渡金属离子半径常用于螯合His标签蛋白的过渡金属离子有Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等，金 属离子的半径越小，与His标签蛋白的结合能力就越强。上述金属离子与His标 签蛋白结合能力的强弱顺序

3、为Cu2+ Zn2+ Ni2+ Co2+2.3缓冲液条件His标签融合蛋白与过渡金属离子的螯合作用受缓冲液的pH值影响。在中 性或弱碱性（pH 7-8）环境下的螯合作用力要强于酸性环境下的作用力。磷酸盐缓冲液中的螯合作用力强于Tris-HCl缓冲液中的作用力。由于咪唑可以和His标签蛋白竞争过渡金属离子，所以缓冲液中咪唑浓度的 升高可减弱上述螯合作用力。对于一些容易氧化的蛋白，往往需要在缓冲液中添 加DTT或巯基乙醇等还原剂，这类还原剂会降低上述螯合作用力。此外，还有 一些与Ni2+等过渡金属离子存在高强度作用力的螯合试剂（如EDTA、柠檬酸等） 会抑制上述螯合作用力，甚至是脱掉过渡金属离子，

4、应谨慎使用。2.4结合时间一定范围内，His标签蛋白与过渡金属离子的接触时间延长，结合能力亦会 增强。3. His标签蛋白纯化常见问题解析3.1蛋白不挂柱His标签融合蛋白不挂柱是由于蛋白和层析介质之间的螯合作用力不足导致 的。根据上述几点的影响因素，亲，您找到原因了么？His标签是否丢失大肠杆菌表达外源蛋白过程中，常出现序列丢失的现象，若是标签丢失，蛋 白自然就无法挂柱了。可采用Western-Blot方法通过His抗体检测目标蛋白是否 存在His标签。His标签是否暴露在融合蛋白表面在蛋白中加入适量的尿素或者盐酸胍等变性剂，若此时蛋白可以挂柱，说明 蛋白表达过程中His标签可能暴露不充分，

5、这个时候可以尝试在缓冲液中加入变 性剂进行纯化。若因蛋白本身原因不能添加变性剂，则只能尝试上游条件的修改， 要么增加His标签长度，提高标签暴露的几率，要么修改His标签的位置。3.1.3更换过渡金属离子如果选择用的是Ni2+或Co2+，换成Cu2+或Zn2+则就有可能挂柱了（亲，只 是有可能哦）。3.1.4缓冲液选择是否正确如果缓冲液中需要添加巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）等还原剂，则需要选 择具有NTA配基的螯合介质（常规条件下选择IDA配基的螯合介质即可）。如果缓冲液中含有EDTA等具有强螯合作用的试剂，应在纯化前去掉。此外，适当提高缓冲液pH值、降低缓冲液中的盐浓度或者更换成磷酸盐缓

6、冲液都可能提高His标签蛋白的挂柱能力。3.1.5提高接触时间适当降低流速，提高蛋白与螯合介质的接触时间，可以提高目标蛋白的挂柱 能力。3.2 His标签蛋白挂柱后洗脱不下来前述的蛋白无法挂柱是因为结合能力不足导致的，那么蛋白挂柱后洗脱不下 来是因为洗脱条件太温和而无法破坏蛋白与过渡金属离子的螯合作用。3.2.1洗脱强度不够可适当增加洗脱液中咪唑的浓度或者降低pH值。3.2.2蛋白和层析介质之间存在非特异性吸附可以尝试在洗脱液中添加去垢剂（如0.2%的TritionX-100）。3.2.3蛋白是否沉淀在层析介质内部可以尝试降低上样量或通过咪唑梯度洗脱的方式来避免蛋白沉淀。3.2.4改变缓冲液条

7、件降低缓冲液pH、提高咪唑浓度、提高盐浓度或者换成Tris-HCl缓冲液都有 可能解决目标蛋白洗脱不下来的问题。3.2.5更换过渡金属离子如果用的是Ni2+，可以尝试换成Co2+，降低目标蛋白与过渡金属离子的螯合 作用。如果上述方法均无法解决问题，只能从上游重新进行载体构建，尝试减少 His标签中组氨酸的数量，或者更换其他的标签。3.3洗脱后的His标签蛋白纯度不够只要蛋白中存在裸露的组氨酸，就存在过渡金属离子与蛋白之间的螯合作 用。因此，如何抑制含有裸露组氨酸的杂质蛋白与介质之间的结合是提高目标蛋 白纯度的关键。3.3.1优化过渡金属离子种类纯度不够的主要原因是宿主细胞蛋白中的一些含有组氨酸的杂蛋白吸附在 鏊合介质上。因此，可以采用螯合能力弱的。2+作为过渡金属离子，使得含有组 氨酸的杂蛋白无法吸附在介质上，从而提高目标蛋白的纯度。3.3.2优化上样和洗脱条件寻找最优的上样和洗脱条件，抑制杂蛋白的吸附（如增加上样缓冲液中咪唑 的浓度），将杂蛋白和目标蛋白尽可能的分开。3.3.3双标签纯化在进行上游构建时，给目标蛋白加双重标签，通过