dna体外扩增技术总结

1、dna体外扩增技术总结目的基因的获取及体外扩增技术概述在基因的研究及体外人工复制过程中，我们通常把需要研究的 基因称为目的基因。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段, 如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。一般来说，目 的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基 因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选 模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用 PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克 隆表达，常用的方法有PCR法、cDNA法及建立基因文库等。PCR法技术及原理聚合酶链式反应(Polymerase Chai

2、n Reaction)，简称 PCR， 是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。它是一种体外 酶促合成，扩增特定DNA片段的方法。1985年由美国Karray等学 者首创了 PCR技术，并由美国Cetus公司开发研制。随着科学技术 的发展和突破，PCR技术已在多个领域得到广泛地应用，如微生物 检测、兽医学、水产养殖等方面。PCR技术模拟DNA的天然复制过程，基于DNA的半保留复制原 理，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物，该原理主 要包括3个基本反应过程：变性一一退火一一延伸。变性主要是指 双链DNA的变性，即双链DNA经加热至93C左右，其热稳定性降 低，配对碱基之间的氢键

3、断裂，使双链DNA成为单链，以便与引物 结合。退火是指单链DNA在温度降低时与引物的复性（称为退火）。 在此过程中，引物与单链DNA模板仍然按照碱基互补的方式配对。 延伸是指引物与DNA模板按碱基互补的原则配对后，在TaqDNA聚 合酶的作用下，以dNTP为反应原料，进行体外的半保留复制，合 成一条新的与模板DNA链互补的新链。经重复循环变性一一退火 延伸3个过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种 新链又可成为下次循环的模板。每完成一次循环需23min，2 3h就能将目的基因扩增、放大几百万倍。一般单一拷贝的基因循 环253O次，DNA可扩增XXX万XXX万倍。由于该技术具有较强的灵敏

4、度，由于产物的生成量是以指数方 式增加的，能将皮克量级的起始待测模板扩增到微克水平。能从 XXX万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度 可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细 菌。同时对标本的纯度要求低，不需要分离病毒或细菌及培养细胞， DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、 体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织cDNA文库法cDNA为具有与某mRNA（信使RNA）链呈互补的碱基序列的单链 DNA，或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的DNA 双链。与RNA链互补的单链DNA，以其RNA为模板，在适当引物的 存在下，

5、由依赖RNA的DNA聚合酶（反转录酶）的作用而合成，并 且在合成单链cDNA后，在用碱处理除去与其对应的RNA以后，以 单链cDNA为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶或依赖RNA的DNA聚 合酶的作用合成双链cDNA。真核生物的信使RNA或其他RNA的cDNA， 在遗传工程方面广为应用。在这种情况下，mRNA的cDNA，与原来 基因的DNA (基因组DNA)不同而无内含子；相反地对应于在原来 基因中没有的而在mRNA存在的3/末端的多A序列等的核苷序列 上，与exon序列、先导序列以及续序列等一起反映出mRNA结构。由于真核生物基因组DNA非常庞大，而且含有大量的重复序列， 很难直接分离得到靶

6、基因片段，而cDNA则来自反转录的RNA，不 含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离得 到相关基因。同时由于RNA分子敏感脆弱，自然状态下难以被扩增， 因此为了研究mRNA所包含的信息，一般将其反转录为稳定的双螺 旋DNA分子(即cDNA)在插到自我复制的载体中即可。此过程包含5个阶段：总RNA的提取。细胞中总RNA包含mRNA，rRNA，tRNA以 及一些小RNA (sRNA)，一个典型的动物细胞总RNA含量中，rRNA 占 XX%XX%，tRNA 和 sRNA 约占 XX%XX%，而 mRNA 只占 1%5%。 同时由于mRNA为单链，容易受核酸酶攻击被破坏，因此要保证

7、环 境和实验器皿没有被RNA酶污染。从而保证被提取物良好的存活率。 思想汇报专题总RNA抽提方法有很多种，目前实验室常用的方法是 用异硫氰酸胍一苯酚抽提法，使用Trizol试剂进行。除此之外还 有硅胶模纯化柱法等。mRNA的纯化。真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征 是具有5端的帽子结构和3端的polyA尾巴，此结构为真核生 物mRNA的提取提供了极为方便的选择性标志。试验中常用寡聚纤 维素色谱柱法获得高纯度的mRNA，在高盐缓冲液下，mRNA被特异 性结合到色谱柱上，再用低盐或蒸馏水洗脱，经两次色谱柱纯化后 即可得高浓度mRNA。目前许多商业试剂盒也可以用作mRNA的纯化， 并且有相当好的

8、效果。操作简便，快捷且灵敏度较高。cDNA的合成。cDNA的合成包括第一链和第二链的合成。 第一链是一 mRNA为模版，在反转录酶的作用下反转录成cDNA.该酶和成DNA时需 要引物引导，常用的引物为oligodT。第二链cDNA的合成是以第 一链为模板，以DNA聚合酶催化。cDNA文库的构建。由于cDNA的长度一般在0.58kb， 常用噬菌体类载体和质粒做载体，将cDNA重组到载体上。合成的cDNA与载体 DNA进行连接一般有3种方法： 借助于末端转移酶的3 -OH端合成均聚物的能力，双链 cDNA和线性化载体DNA的3 -OH端分别加上均聚核苷酸链；通过粘性末端连接。然后重组的载体DNA分

9、子在一定条件下转化入大肠杆菌，形 成携带质粒的菌株。当不同重组的DNA含有不同的cDNA基因时，整个转化子含 有来自mRNA群体的各种cDNA基因，这样的转化子群体构成该 mRNA全部遗传信息的cDNA基因文库。（5）基因文库的筛选。基因文库的筛选是指通过某种特殊的 方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆过程。用于从cDNA文 库中筛选和鉴定目的cDNA的方法主要有核酸杂交，免疫学杂交检 测，cDNA同胞选择，PCR筛选法等。化学合成法自然界中有些组织特异性mRNA含量很低，很难用cDNA法克隆; 同时有些基因比较短，如：生长激素释放抑制激素基因、脑啡肽基 因、胰岛素基因、干扰

10、素基因等，采用基因文库方法合成过程比较 复杂而且时间成本比较高，相比采用化学的方法合成成本更低，这 就需要我们采用化学的方法对其进行合成。化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个 个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分 离、缩合、分离、去保护五大操作单元。同时DNA化学合成不同于 酶促的DNA合成过程从5-3方向延伸，而是由3端开始，其合 成法的前提必须是已知目的基因的DNA序列，一般情况下化学合成 的DNA片断一般局限在200bp以内。从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法、 亚磷酰胺三酯法；具体操作过程又有液相合成和固相合成两种形式。 目

11、前，一般DNA合成都采用固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，此 方法具有高效、快速偶联等优点，已在DNA化学合成中广泛使用。其合成方式根据所合成DNA片段的大小一般分成三种：（1）小片段粘接法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段。 片断之间有互补区，混合退火形成有断点的双链，再由T4 DNA ligase连接成完整双 链。（2）补钉延长法：分别合成12-15bp的单链DNA小片段及 20-30bp的单链DNA中片段。片断之间有局部互补区，可相互作为另一个片断延长的引 物，用Klenow酶延伸成完整双链。（3）大片段酶促法：分别合成40-50bp的单链DNA大片段。 片断之间有局部互补区，可

12、相互作为另一个片断延长的引物，用Klenow酶延伸成完整 双链。三种方法各有利弊：小片段粘接法中化学合成DNA的单链片段 愈短，收率愈高；但化学合成的份额较大，成本较高，由于大片段 化学合成的收率极低，如合成50bp的DNA单链大片段的总收率仅 XX.X%。故一般采用大片段酶促法，其化学合成的份额较小，成本 较低；随着生命科学和分子生物学等相关基础学科的发展，分子生物 相关领域也在不断创新。生物基因工程，杂交育种，DNA检测等一 系列技术也越来越多的应用到了我们的生活中，包括工业，农业， 畜牧医疗等行业，而目的基因的获取作为这些工作的第一步，尤其 显得重要。近年来，越来越多的基因技术被用在医疗

13、诊断，药物研 发治疗领域，尤其癌症，艾滋等一系列恶性疾病的诊断与治疗中， 相信随着分子生物这一学科领域的持续发展，这些恶性疾病被攻克 为期不远。参考文献：1李莹.DNA体外扩增技术一聚合酶链式反应(PCR) J -沈阳师范学院学报(自然科学版).20XX,18(4) 2邓小红，任 海芳.PCR技术详解及分析J-重庆工商大学学报(自然科学 版).20XX,24(1) 3郑景生，吕蓓.分子植物育种J-分子 植物育种20XX,1(3)朱玉贤，李毅，郑晓峰.现代分子生物学(第3版).北 京:高等教育出版社，20XX： 167176毛新国，景蕊莲，孔秀英，赵光耀，贾继增.几种全长 cDNA文库构建方法比

14、较J-遗传.20XX,28(7) 6李鹏，刘 文忠，栗艳.三种获取目的基因的PCR方法J-乳业科学与技 术.20XX,(4) : 195198 7张京生，董自政.化学合成DNA片 段的鉴定及纯化J-军事医学科学院院刊.1990,(04)8段海燕，章锦才，黄萍，张蕴惠.四种方法获取DNA用 于检测IL-1基因多态性的比较分析J-华西口腔医学杂志20XX,19(1)9孙春晓，于常海.基因克隆的常用方法介绍J -生理 科学进展.20XX,31(1)篇二：核酸体外扩增技术创新助手报告主题分析报告创新助手平台提供北京万方软件股份有限公司20XX-06-27报告目录报告核心要素I一、主题简介1二、主题相关

15、科研产出总体分析12.1文献总体产出统计12.2学术关注趋势分析2三、主题相关科技论文产出分析23.1中文期刊论文23.1.1近十年中文期刊论文分布列表23.1.2中文期刊论文增长趋势33.1.3发文较多期刊43.1.4发文较多的机构43.1.5发文较多的人物53.1.6核心期刊分布数量对比53.1.7最近相关中文期刊论文63.1.8被引较多的相关期刊论文.73.2学位论文83.2.1近十年学位论文年代分布列表83.2.2学位论文增长趋势93.2.3硕博学位论文数量对比.103.2.4发文较多的机构103.2.5发文较多的人物103.2.6最近相关学位论文103.3中文会议论文103.3.1近

16、十年中文会议论文年代分布列表103.3.2中文会议论文增长趋势.113.3.3中文会议论文主办单位分布123.3.4发文较多的机构123.3.5发文较多的人物123.3.6最近相关中文会议论文123.4外文期刊论文123.4.1近十年外文期刊论文年代分布列表123.4.2 外文期刊论文增长趋势133.4.3最近相关外文期刊论文.133.5外文会议论文13I篇三：核酸体外扩增技术综述核酸体外扩增技术研究进展摘要体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高 效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学 和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。 核酸体外扩增是分子

17、生物学研究的基础。随着生物技术的发展，出 现了越来越多的核酸体外扩增技术。就现有的核酸扩增技术的原理、 特点及应用进行介绍。关键词 核酸体外扩增 聚合酶链式反应（PCR） 等温扩增核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最 基本物质之一。核酸广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物内。核酸大 分子可分为两类：脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），在蛋 白质的复制和合成中起着储存和传递遗传信息的作用。核酸不仅是 基本的遗传物质，而且在蛋白质的生物合成上也占重要位置，蛋白 质是生命活动的表达物质，基因则是编码蛋白质的特异的核苷酸序 列，因而核酸在生长、遗传、变异等一系列重大生命现象中

18、起决定 性的作用。而在1983年人类第一次能够在体外扩增DNA之后，对 核酸的操作和利用进入了一个全新的革命性的阶段，直到现在，体 外核酸扩增技术仍然在不断地改进和完善，新的核酸扩增模式也不 断涌现1。一、聚合酶链式反应（PCR）PCR （Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点， 通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的 子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在 体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表 达调控，基因多态性研究等许多方

19、面2。聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、 特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可 见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及 生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建 立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩 增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接 酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法 都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交 捕获、侵染（Invader）和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既

20、能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。二、核酸等温扩增技术1=1等温扩增技术(Isothermal Amplification Technology)是核 酸体外扩增技术，其反应过程始终维持在恒定的温度下，通过添加 不同活性的酶和各自特异性引物来达到快速核酸扩增的目的。近年 新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求 方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖， 在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩 增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用，其他 一些新发展起来的等温扩增技术，如链替代等温扩增、滚环等温扩 增、依赖解旋酶

21、等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩 增和核酸快速等温检测放大等技术，也在不断发展与完善之中3。1、链替代扩增技术链替代扩增，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的DNA体 外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切DNA识别位点的能力 和DNA聚合酶在切口处向3延伸并置换下游序列的能力，在等温 条件下进行扩增。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚 合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。SDA 的基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的 DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。整个过 程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目

22、的DNA片段、SDA 循环扩增3个步骤组成。2、滚环扩增技术滚环核酸扩增(rolling circleamolification，RCA)是通过 借鉴病原生物体滚环复制DNA的方式而提出的，可分为线性扩增与 指数扩增两种形式。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA 聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状DNA完全 互补)的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增仅限于一些具有环状 核酸的病毒、质粒和环状染色体。指数RCA原理与线性RCA相同， 采用与环状DNA序列完全一致的第二种引物，该引物与第一次线性 RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为第一种探针的模板，这样 一来在很短的时

23、间内，产物呈指数递增。3、依赖解旋酶DNA扩增依赖解旋酶DNA等温扩增技术是美国NEB公司于20XX年发明 的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DNA复制的自然过 程，利用解旋酶在恒温下解开DNA双链，再由DNA单链结合蛋白稳 定已解开的单链为引物提供模板，然后在DNA聚合酶的作用下合成 互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的 指数式增长。4、依赖核酸序列扩增依赖核酸序列扩增技术是一项以核酸序列中RNA为模板，由两 个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促 过程4。5、环介导等温扩增环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65C左右处于动态 平衡状态，

24、任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸 时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特 异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作 用下，以外侧引物区段的3末端为起点，与模板DNA互补序列配 对，启动链置换DNA合成5-6。6、单引物等温扩增技术单引物等温扩增技术的核心是一条混合引物及可以切割 DNA/RNA杂合链中RNA部分的RNA酶，由由3端DNA部分和5 端RNA部分组成。切割酶作用后暴露出模板上与引物RNA部分结合 的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过RNA降解、新 引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。7、快速等温检测放大技术快速等温检测放大技术最早由中科院研究人员于20XX年发明。 技术的核心是在待检测样品的核酸中加入含有切刻内切酶识别位 点的单链检测探针及切刻内切酶，检测探针