培养基整体性能评估与快速检测技术

1、培养基整体性能的评估与快速检测技术的应用Jiwen.1公司简介广东省科学院微生物研究所控股的国家级高新技术企业。国家食品卫生标准委员会微生物标准协作组的成员，承担起草食品安全国家标准GB478.28培养基和试剂质量控制方法 。起草GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法及多项地方微生物检验标准。中国微生物学会培养基学组成员。公司生产研发基地总建设面积达12000m2，拥有GMP生产车间和6条先进生产线。拥有华南地区最大的菌种资源保存中心。23主要产品 微生物干燥培养基标准化微生物干燥培养基抗干扰微生物培养基显色微生物培养基一次性成品培养基标准菌株微生物生化鉴定盒HKM-MID生化鉴

2、定系统HKM乳胶凝集快速鉴定系统霉菌、大肠菌群计数卡4系列培养基产品食品卫生微生物国家标准（GB4789）全系列天然矿泉水微生物国家标准（GB8537)全系列生活饮用水微生物检测标准全系列美国FDA, EP，ISO，USPSN标准全系列中国药典全系列化妆品检验系列 5培养基、试剂质量控制-GB4789.28修订依据：ISO/TS 11133-1：2009；ISO/TS 11133-2：2003；评估培养基整体性能的指标：理化指标；微生物学指标。6理化指标培养基的色泽培养基的水分含量培养基的澄清度培养基的pH固体培养基的凝胶强度培养基的色泽培养基的水分含量培养基的澄清度培养基的色泽培养基的水分含

3、量培养基的pH培养基的澄清度培养基的色泽培养基的水分含量固体培养基的凝胶强度培养基的pH培养基的澄清度培养基的色泽培养基的水分含量培养基的色泽培养基的澄清度培养基的水分含量培养基的色泽培养基的pH培养基的澄清度培养基的水分含量培养基的pH理化指标通常由生产厂商通过对原材料、生产工艺、生产过程进行质控，使用者通常用感官检查或pH测定进行确认。7微生物学指标培养基对非目标菌的抑制能力(选择性)培养基对目标菌的促生长能力(生长率)培养基的指示能力(生化特性)8微生物学评估方法-使用一套合适的质控菌株进行测试定量法培养基生产厂家或对培养基质量有特殊要求的实验室对培养基质控 ；半定量法实验室对培养基的质

4、控；定性法实验室对培养基的质控。9质控菌株的要求具典型反应特性的生长良好的阳性菌株 ；弱阳性菌株（对培养基中选择剂等试剂敏感性强的菌株）； 不具有该特性的阴性菌株； 部分或完全受抑制的菌株； 10固体培养基的生长率测试-定量法选择合适稀释度的质控菌悬液(目标菌)0.1mL，均匀涂布接种于待测平板和参比平板。每一稀释度接种两个平板。并按标准规定的培养条件培养平板。计算生长率PR ： PR = NS/N0PR：生长率。NS：待测培养基平板上得到的菌落总数。N0：参比培养基平板上获得的菌落总数(该菌落总数应100CFU) 。11固体培养基的生长率测试-半定量法将质控菌株接种到非选择性肉汤培养过夜。用

5、1ul接种环按图划线接种：计算生长指数G：每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上G最大为16。如果仅一半的线有菌落生长，则G为0.5。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则G为0。记录每个平板的得分总和便得到G。12固体培养基的生长率测试-定性法将质控菌株接种到非选择性肉汤培养过夜。用1ul接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线（细菌），或用接种针直接挑取斜面培养物点种接种（霉菌）。并按标准规定的培养条件培养平板。培养后按以下方法对培养基计分：0 表示无生长；1 表示微弱生长；2 表示生长良好。13固体培养基生长率评价标准非选择性固体培养基和固体计数培养基PR值应

6、不小于0.7；G值应大于6。选择性固体培养基PR值一般应不小于0.5，最低应为0.1 。选择性计数固体培养基上目标菌的生长率一般不小于0.7 。定性法目标菌得分应为2。14固体培养基选择性测试-半定量法将质控菌株接种到非选择性肉汤培养过夜。用1l接种环取选择性测试工作菌悬液1环，在待测培养基表面划六条平行直线(如图)，同时接种两个平板，划线时可在培养基下面放一个模板图，按标准规定的培养条件培养平板。15固体培养基选择性测试-半定量法计算G：每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上最多为6分。如果仅一半的线有菌落生长，则G为0.5。如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则G为0

7、。 评价标准：G应小于6。16固体培养基生化特性测试-定性法分别观察质控菌株(包括目标菌和非目标菌)在培养基上形态、颜色及生化特征。评价培养基的指示系统是否正常。17GB4789.28规范性附录F -表F.1培养基 状态 功能分类质控指标培养条件质控菌株参比培养基方法质控评定标准特征性反应亚硫酸铋琼脂(BS)固体选择性分离生长率361/40h48h 伤寒沙门菌CMCC(B)50071 TSA定量PR0.5 棕色或绿色菌落 鼠伤寒沙门菌ATCC14028 选择性大肠埃希菌ATCC 25922 _半定量G1 _粪肠球菌ATCC 29212 _HE琼脂固体选择性分离生长率361/18h24h鼠伤寒沙

8、门菌ATCC14028TSA定量PR0.5绿-蓝色菌落，有黑心 福氏志贺菌CMCC(B)51572 绿-蓝色菌落 选择性大肠埃希菌ATCC 25922_半定量G6 _粪肠球菌ATCC 29212G1_18来自广东省CDC的评估报告-目标质控菌株在不同厂家培养基上生长率的比较 2009.112010.10培养基生产厂 测试菌株检测菌株数生长率PRF值P值XLD琼脂HK鼠伤寒沙门菌CMCCB) 5011560 0.9640.09518.520.000X200.8520.117HK福氏志贺菌CMCC(B) 51572600.7710.114-5.4860.000X200.4480.199 HE琼脂H

9、K鼠伤寒沙门菌CMCCB) 50115600.9270.089 -4.233 0.000X200.7840.162HK福氏志贺菌CMCC(B) 51572600.6830.155 -4.636 0.000X200.4690.112 沙门显色培养基HK鼠伤寒沙门菌CMCCB) 50115600.8760.054 12.0670.001X200.8250.066 注：X为国外某品牌培养基生产厂家。19来自广东省CDC的评估报告-目标质控菌株在不同厂家培养基上生长率的比较 2009.112010.10培养基生产厂 测试菌株检测菌株数生长率PRF值P值TCBS琼脂HK副溶血性弧菌ATCC1780260

10、0.6190.211-1.195 0.232X200.5360.280HK霍乱弧菌VbO600.5280.261-2.874 0.000X200.2120.193弧菌显色培养基HK副溶血性弧菌ATCC17802600.8960.0626.325 0.000X200.6280.125 HK霍乱弧菌VbO601.1820.108 4.860 0.030 X201.1160.137 20来自广东省CDC的评估报告-野生分离目标菌株在不同厂家培养基上生长率的比较 2009.112010.1021来自广东省CDC的评估报告-野生分离目标菌株在不同厂家培养基上生长率的比较 2009.112010.1022

11、来自广东省CDC的评估报告-不同生产厂家培养基对非目标质控菌株的选择性比较 2009.112010.1023来自广东省CDC的评估报告-不同生产厂家培养基对非目标质控菌株的选择性比较 2009.112010.7培养基测试菌株生产厂检测份数菌落生理、生化特征XLD琼脂鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115HK60黑心、无色、半透明菌落X20黑心、无色、半透明菌落福氏志贺菌CMCC(B)51572HK60无色、半透明菌落X20无色、半透明菌落HE琼脂鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115HK60黑心、无色、半透明菌落X20黑心、无色、半透明菌落福氏志贺菌CMCC(B)51572HK60无色、半透明菌落

12、X20无色、半透明菌落沙门菌显色培养基鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115HK60紫红、中等大小菌落X20紫红、中等大小菌落24来自广东省CDC的评估报告-不同生产厂家培养基对非目标质控菌株的选择性比较 2009.112010.725来自广东省CDC的评估报告-不同批间培养基的稳定性测试2009.112010.10培养基厂家与批次测试菌株检测份数生长率PRF值P值HE琼脂HK 09110104Y鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115200.9290.0970.0120.989HK 09110204Y200.9260.094HK 09110304Y200.9250.080HK 09110104Y福

13、氏志贺菌CMCC(B)51572200.6780.1520.0690.934HK 09110204Y200.6940.168HK 09110304Y200.6780.152XLD琼脂HK 09102301Y鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115200.9670.9010.1590.853HK 09102401Y200.9730.102HK 09102501Y200.9620.089HK 09102301Y福氏志贺菌CMCC(B)51572200.7810.1220.1410.868HK 09102401Y200.7710.097HK 09102501Y200.7610.12626来自广东省CDC

14、的评估报告-不同批间培养基的稳定性测试2009.112010.10培养基厂家与批次测试菌株检测份数生长率PRF值P值沙门显色培养基HK 09110104Y鼠伤寒沙门菌CMCC(B)5011520O.8790.0400.7090.496HK 09110204Y20O.8760.055HK 09110304Y200.8750.067弧菌显色培养基HK 10072101Y副溶血性弧菌 ATCC17802200.8970.0660.0180.982HK 10072304Y200.8940.051HK10072401Y200.8970.070 HK 10072101Y霍乱弧菌VbO201.1850.10

15、3 0.230.795HK 10072304Y201.1690.105 HK10072401Y201.1920.120 27小结目标菌(目标质控菌和野生分离株)在受试培养基上的生长率(PR均0.5)高于对照的培养基，经统计学分析，差异有显著性(P0.05)。质控菌株在受试培养基上呈现正常的特征性反应，与对照培养基完全。不同批次培养基之间的整体性能差异无显著性(P0.05) 。28结论依据ISO/TS11133.2-2003培养基的性能评价标准判断，受试培养基符合标准要求，整体性能稳定、一致。29GB4789中快速检测技术的应用显色培养基沙门菌；志贺菌；副溶血性弧菌；O157：H7大肠埃希菌；单

16、增李斯特菌；阪崎肠杆菌；大肠杆菌计数。商品化的微生物生化鉴定系统全自动微生物生化分析系统；数值编码的微生物生化鉴定条。30显色培养基显色培养检测基本原理：利用不同种属细菌代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相应的特异性酶底物和抑制剂，当具有某特异酶的细菌与酶底物作用时，使显色基团游离出来附着于菌落上，形成颜色独特的菌落。根据菌落的颜色直接对菌属(种)作出鉴定。31显色培养基的优势快速、简便、节省时间-大多数显色培养基只需在样品增菌后，分离培养1824h，即可根据菌落的颜色作出初步的鉴定。(阴性-弃去；阳性-进一步鉴定)。结果直观，一目了然(根据颜色判定结果)。灵敏度高、特异性强，大大减少了后

17、续的鉴定步骤(确证试验)。32显色培养的缺陷假阳性：97%的大肠埃希氏菌含有-葡萄糖苷酶，约10%的沙门氏菌属中也含有此酶。假阴性：O157：H7大肠埃希氏菌不产生-葡萄糖苷酶。另外，不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中阳性反应。与普通选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率相对要低得多。33目标菌在显色培养基上生长率的比较34显色培养基对非目标菌的选择性比较35非目标菌在显色培养基上的特征性反应比较36来自河南CDC的验证-二种沙门菌显色培养基实际应用效果比对研究 样品n CHROMagar HKM有可疑菌落样品数确认阳性样品数阳性分离率(%)有可疑菌落样品数确认阳性样

18、品数阳性分离率(%)生鸡肉86474754.65565665.12生猪肉768810.5310810.53鸡肛拭子488816.6710816.67合计210636330.00767234.2937结果沙门氏菌在HKM沙门菌显色培养基上较CHROMagar沙门菌显色培养基菌落大，色泽浓，数量相似；对162份生肉食品检测，HKM沙门菌显色培养基阳性分离率为39.51，CHROMagar沙门菌显色培养基阳性了率为33.95，二者无显著性差异；48份鸡肛拭子样品，二者检出率相同，无差异；HKM沙门菌显色培养基的假阴性率低于CHROMagar沙门菌显色培养基（2.38和6.67），但二者无显著性差异。

19、 38微生物生化鉴定系统生化鉴定条：操作简便，不需仪器完成实验；提供庞大的鉴定数据库；进行数值分类鉴定；良好的鉴定效果；快速报告。39HKM- MID细菌生化鉴定条MID革兰阴性杆菌生化鉴定条(MID-GNA、MID-GNB )GN A+B主要用来鉴定非苛养革兰氏阴性杆菌（包括氧化酶阴性和阳性菌），共包括28个属。GNA主要用来鉴定非苛养革兰氏阴性杆菌(氧化酶阴性)，共9个属(不动杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、小肠结肠炎耶尔森菌等)。免费提供数据库软件。40检测原理GN A和GN B鉴定条均分别由12个含干燥培养基的小管组成；将需鉴定的菌悬液

20、接种于小管中。培养一定时间后，通过代谢作用(或是加入配套试剂后)所产生的颜色变化，进行数值编码；根据数据库提供的资料，判定结果。41HKM-MID细菌生化鉴定条操作程序42第一步：挑取可疑菌落纯培养物(或单个菌落)于35mL灭菌生理盐水中制备成菌悬液。并按说明书要求作氧化酶试验，根据结果选用鉴定条。1243第二步：小心的打开鉴定条的粘性封口膜，用无菌滴管加3-4滴（约100微升）菌悬液至每个小管，按说明书在需滴加矿物油的小管加入矿物油。 3444第三步：用粘性封口膜封住管口，放至35-37的培养箱中培养1824h。 545第四步：结果判读：参考说明表及反应结果对照卡读GN A和GN B的反应结

21、果。646第五步：将每三个反应分为一组，每组中反应底物下面均标有1、2、4数值，将每组中阳性反应对应的数值加起来，将得到一个四位数（GN A）、或者八位数（氧化酶阴性GN A+B）或者九位数（氧化酶阳性GN A+B），将这个数值输入选择的GN A或GN A+B电脑鉴定软件系统，将得到鉴定结果；鉴定结果将显示五个最有可能的结果，以及每个结果的可能性几率以及相似性。并且对鉴定结果给予总的评价。74748第六步：软件检索将结果编码输入电脑样品信息区可选的数值输入自动提示可疑测试可能的错误测试提示广泛的结果分析概率百分比概率可能性可疑测试49第七步：报告结果50HKM-MID常用生化鉴定条HKM-MI

22、D产品：革兰阴性杆菌鉴定系统；葡萄球菌鉴定系统；李斯特菌鉴定系统(经AOAC验证)；芽胞杆菌鉴定系统；链球菌鉴定条系统。51常用的MID鉴定条鉴定结果副溶血性弧菌沙门菌 阪崎肠杆菌 单核细胞增生李斯特菌52菌株测试菌数APIMID GN AE.coli大肠埃希氏菌434343Shigella spp.志贺菌属444S.sonnei宋内志贺氏菌333K.pneumoniae肺炎克雷伯氏菌131313K.oxytoca产酸克雷伯菌111111E.cloacae阴沟肠杆菌887E.aerogenes产气肠杆菌333S.marcescen粘质沙雷菌222C.freundii弗氏柠檬酸杆菌999C di

23、versus差异柠檬酸杆菌222H.alvei蜂房哈夫尼菌111P.mirabilis奇异变形杆菌111111P.vulgaris普通变形杆菌222P.stuartii斯氏普罗威登斯菌222Salmonella spp.沙门氏菌838383总共197197196HKM-MID GNA 与API20E鉴定结果比较53HKM乳胶凝集快速鉴定系统原理：乳胶凝集试验是以乳胶微粒为载体的间接凝集试验；用人工方法将抗体包被于与免疫无关的大分子乳胶颗粒上；利用抗原抗体特异性结合的特性，当致敏的乳胶颗粒与待检细菌的菌悬液混合后，迅速形成肉眼可见的凝集团块，用于筛选鉴定可疑菌。54乳胶凝集试验的优势特异、敏感；

24、操作简便、快速；结果易判读。55常用的HKM乳胶凝集快速鉴定系统李斯特菌（listeria）沙门氏菌（salmonella）弯曲杆菌（camylobacter）大肠杆菌O157（E. coli O157）军团菌（legionella）葡萄球菌（staph）56HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒操作步骤将可疑菌落涂布于检测板的反应环内。57HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒滴加1滴乳胶测试试剂。58HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒用搅拌棒混匀5-10秒钟59HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒轻轻摇动检测板，2分钟。60HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒观察凝集结果。产生凝集反应(阳性

25、)阴性反应阳性对照阴性对照61快速检测技术应用案例分析基本情况：2003.9.23上午8时，当地CDC接报22日晚10时左右某市第4中学有29名学生因发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻到医院就诊。到23日上午10时已有96人患病。23日下午14时，该市与第4中学邻近的一个镇，出现相同症状的病人，病人主要是当地居住的村民。23日晚上22时左右，两地共有236人就诊。主要症状：发热：39以上5%， 39以下75%；腹泻91.7%，腹痛82.9%；恶心44.8%，呕吐41.7%，头痛9.4%。62流行病学调查报告：第4中学22日7时30分左右，早餐供应凉拌河粉，午餐除继续供应河粉外，还有米饭、猪肉炒菜、豆

26、腐、咸萝卜。发病村民均在22日或23日进食过河粉。河粉由某镇生产点生产，9.21晚生产了800斤。22日早上6时30份供应第四中学450斤，其余由4名小贩在附近销售。该生产点卫生状况差，盛粉的容器及生产用具4天清洗一次，盛粉的容器旁放着猪饲料桶，生产点与猪圈相连。首例发病潜伏期：15h。63实验室接收第一批样本的时间：23日下午17时30分。样本种类：呕吐物2份；病人肛拭子37份；剩菜、豆腐各1份；家庭用井水、自来水各1份；食用油、生产河粉的工具拭子等4份；共46份样品。6423日下午17时30分：通过对流行病学调查报告分析：确定重点关注的样本：河粉生产工具拭子、呕吐物、肛拭子。确定检测的方向：由患者的临床症状和发病潜伏期提示感染性腹泻可能性较大。将肠道致病菌列为重点检测方向。根据对生产现场卫生状况的分析，将沙门氏菌列为重点中的重点。65实验室检验- 23日下午17时30分直接分离：取呕吐物、肛拭子、用具拭子直接划线分离于DHL、HE、沙门菌显色培养基、弧菌显色培养基、大肠杆菌O157显色培养基、血平板和普通营养琼脂平板。增菌培养： SC、肠增、G