GelZymography明胶酶谱法

1、明胶酶谱法原理：酶谱法的基本过程是先将样品进行聚丙烯酰胺（，含明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的（基质金属蛋白酶）和恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与和活性成正比。复性原理：在电泳过程中，与样品中的结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置中洗脱（最好是放在摇床上摇,静置于中是不妥的）时，由于恢复了活性。/次，做次或次，次。被结合而去除，从而使试剂的配制配制聚丙烯酰胺凝胶（含明胶，配好后周内使用，明胶含量低灵敏度高）A分离胶的配制（注：

2、根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）聚丙烯酰胺凝胶（包括）丙烯酰胺）水浴溶解）30储%备胶（0.8（过硫酸铵（）明胶（明胶浓.缩胶的配制浓缩胶30储明备胶10过明硫酸铵60ul）-甘氨酸电极缓冲液i甘氨酸，（8x上样缓冲液甘明油溴酚蓝洗）脱液：40分钟两次，中间换液,（分钟次）（孵甲%醇，10乙%酸（染色3小时）0%乙,酸1浓0度%分,别为10%,1（5漂）洗液：50mmol/L，T孵育液：育42小时）染色液：亮蓝脱色液A、：甲醇浓度分别为（分别脱色）实验步骤取对数期的癌细胞在的无血清培养基中培养4次日收集上清液，将上清液移入离心管中离心，C储存备用。（3根）据细胞计数调整各组细胞培养上

3、清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与X上样缓冲液混合，样本上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）配制分离胶和浓缩胶，孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量）,C进行电泳约小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。TOC o 1-5 h z电泳结束后将凝胶置于洗脱液1,L中振荡洗脱次每次分钟然后用漂洗液除不含外其余同洗脱液漂洗次每次分钟接着将凝胶置于孵育液中C孵育2孵育结束后经染色液亮蓝、甲醇、乙酸染色及脱色液、甲醇浓度分别为、乙酸浓度分别为、分别脱色、后，显示出和为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

4、注意事项：制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。（3用）大梳子孵育液的最好在-复性的时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。孵育的度不要在培养箱中，因为会改变孵育液的值，在普通孵箱即可。（6明）胶要4度保存，配好后1周内使用凝胶制备：（1玻）璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。配分离胶，和作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/处4，上面加满水压平。配浓缩胶，同样地，和最后加，分离胶灌入约后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。（4将）上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约后凝固可用。（5拔）梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。【某种酶蛋白活性分析】（1）用于测定蛋白酶活性。（2）三个主要内容：生物轭合物；试剂盒；分析方法。（3）生物轭合物包含：连接物；荧光剂；猝灭剂。（4）连接物包含能识别所检测的酶并且与之相互作用的部分；荧光剂包含多种荧光物质，并与所述连接物的第一位置轭合