lamp引物设计入门

1、引物设计简介第一部分，如何查找序列首先，登录美国国立生物技术信息中心的网站，网址c查找我们所需要的序列，具体操作如下：点开的主页，点开，选中下拉菜单中的，然后在右边对话框中输入我们所需要查找的物种的拉丁名以及基因的英文名称。IWlUuVYi-TiUf*RL-IU-bliOIGIUSnjGiainLGLI1eeuoiuesg选中tidd在此处输入需要查找的信息npujiaEiouE：enpiLitqs|9|t閃山pc肌jctcx血i!咛DoJMOqs:g甸ICBIq卑solJODie:vus.sgq湘n?iu3c=l丸叭slgWCBIAninP6cpauuebLXSIUeeuGGGUGIIC3蚩

2、lAlGqiCILGGGUG?罟=XblGE2!CUGGUCLUGMrc|GO|iCGgoiuauEgaunciLGssrva丄CUVStfUVbnpHSQHS9CUGLJCgja晋0ICiS?=SA2porOeVCBiINESIOLfIOLdSLISSJIXIgG2G9iCpI?23ESGq?bnpHGqcsliVIIKGSoniCEa“scmir&r!2(V-S)guc匸別叩珮bioAi：qiucaccess|cpmGqcgiauqSglzlliicluiomajcwIPGHaflOJ9|CGJ(eLLBO|GCJUO|O0|UlOLUUiOU9qA3LCG?KIGLCGBCOK2kGib

3、npHGqMCBIHOiveMG|coibgomcB!bobn|SL中EWIGC卩U3|閃IUPlUJ即OUI/9JIOU3IQGUJGL10i比如说我要查找大肠杆菌的的序列，那么只需要将大肠杆菌的拉丁名以及输入即可，如下图所示，然后点击50IEcpeijcpico|i2L9iugyaaLpoeobusitteu3:b9E5|sedneucsE8C|JGLicp!?co|isfiaiu3GJ5J5J60LpoLiJissdneucsE空卩典舁用如I!即yuJ腕叩醫01開I也伸社61JG旳中刖抚d吧LKE2GdnGUC5射唧I?23IOG1LKbGqCGJ；L3|ynjjiuccoccr?pae

4、ne?yiccdejohic2C9|oqJ/Apo|6cbuollsIIGLSIJS-tOLU0|Oa?.啓U0lL3g朋花GUG|!C3?HGqtCIJGCGLG3$mcBlK那U3OU91K?|LK：1LS?典9弩gop.SLGqgjgpsBGEWTCtlELUbLQIGIJeGUG?&UCUGbnJGqHC9iJCtiGUJicsis啻gtoe?3.e讷:c(ui医诃fmtIPiWu|oIpncL|Egbglcp麺I騙q?HC田HomeVCC毎即Lf：DS5E疲仪Cl：J331I58k.OCH?b(IJG9LD：MVjg-?pojcnj36dnejc&sspujiyUvE型一陆店I晒q护

5、NG肚弍yccffl申LI：也购巧昭eI：:110 x3ie3科曲曲舐dhv2BWtYOeDpefbCDJEJ|9fGgBCilGUCrS尹：施v.583jerJV入lAi!医乂MbcfflEBu：vsariei：iMoa比斑pb團曲LDifly-gnpjieaow?剖阴羽归阳疋驰的ukdloipglmc題HQ-丄恥:関JOA|ogocujbi?fjsbGCjJC说衍G|HC9I-dwJcsqKGCGIWcLschigIcq?:讥即卫qg9n?ud1C3Iaop.SLGVIItjssocLce即託nice圍iv-slMe|C0tJ6(oI4CBImW利督LV?_V|H-1iP?LTS-Kguq

6、e呦补注Ee：?0Ot：2EILEIILICZ氏口EWmmygLatlTj?LV3-VSL33J-CBb：3eecLBUKb1SR2J第二部分序列比对目前有一些分子生物学软件可以用于序列比对分析，像DNAST、A、等等，这里我们以为例进行讲解。首先，将目标序列和其它需要与其比对的序列放入一个文本文档中，以大肠杆菌的为例，格式如下图所示:ecoyiYyciviLLeYycceiYeiiwivczccviyvteLcccwevccveYeccvccHCiViYy2Yy2C2K-CLCllICCKViDC-veiee2CCVCC3C-L3VCIWL31CICCeiC2C13YL3W：LCYy2Yei

7、I23VLCYie2CL2YeVI：eWC2CL20C210：331cvicieccicv-LiDc-iwcyvceiwc的下拉CVCC订胆胆KeiKKYWGVTOMeil肥门丄VYCKOC齐胆尤亞匸視C吨IK止化IWlCXllWlCiiei3YlCVCyViei3CViDC-eL2YyiYCL3CCCC21L21VCYCCC2CCCVi7CCWe2CCVCCLCVETy2ie2C：DC-：LC2CCV113C-Vi3ICICCyVCL2CV1HCCVlCVTeiCe3;cv:cvie2cc2i2ecy2ce2ivcvceL2CLVcyvie3cecviycw-vew3ccycci2(C3CC

8、lC2CC2CCX-vlCVCVi3YCKCCVCL2YIVillCi3VCeVYe21CX-eCyCCI2YVi3cic:icvcciceK-LK-icwK：icceiLWCL2cc3cvcvcce2YycccnvLccLiienec；2i:evcyiccvce3W3iiiicy2YevievLicL2ccuC3c-e?vcc2ievcvcve3icciocvie3vucceczccvcwczceicecvieiLuyviLvLccyvcezcvvcLiYczieieiGCiiic2ccvccLWDC-cciiyvc：DC-vec2ic2oe-LCXce2Yy2c:iwrCL2Yyvievc

9、wcvceviLvevLvCXie2iy2iccvC3cceiYyvcevieLcevciL2cy2c：KL3cccnev(ecLX-ViYyiYczc-eK-eDC-vccocXceevceeLvcicTOeiccwceiceoviVLVCLCCCVYe2I23VeLCIC2iy2YeeXy2Vyill3CVi3C-2ilYe2CeiCWL3CCLVCy2YLCCi3Ivce2YC2CViX-CllICLIYVi3ICVL2ieVWLCCXei3CCL2YyCC2X-erCL2CVICLi3Vi3CViXCe21WC2DCeLCCCVCCVCCDC-CX-LWiy：CCVt-e3ICCWe2

10、CLIWLCe3WLIVCKe3F开MMEJGA5.0件，点击AAlig的下en菜tt单，选關仙AAl(开MMEJGAJScISm点击AAltiiLgn的下菜单，D选取AAAl菜单eyLLSvcvecviecvaccvcvizjcewcicyavceiccvcycicziViDc-eivcczvczYeL，选取(EELdiitt/ABiuiigndmeinxtwcxMTC口陀代刖_p：iig；_-ps卸Iq&?：=g=$=：njhq_-：L=$q:$3GL&gpqutnz|C9|izu：gDErvsi淬呷$(5nstDP911诉C-btugg.sq郭加咗订洱斗oirEq护厭dGucL帯ij_L

11、9c&j|Eq.jc|iauiM&u桝和)g：gH二q菲：|l=U：GQDG.SI?匕卩*匪凸rS=L|.ffinl.lZGZI?2&GC|I汕|-|g：=?口H住7陡三亠拎亠淀严亠鱼嗟ig亠史亠亠輕Q亠曙亠匝前平hS口PJECV叮匚忖口圧口岡歸出现一个的对话框，然后选择，点击出现下面的对话框，选择软件就会出现下图的界面，单击，选择下拉菜单中的D邓呂Eq|i3ujj&u|：您spg&cnuzGLQizbpX卜耳匕關12：V|日UUJLlfXb|OLGL软件就会出现下图的界面，单击，选择下拉菜单中的D邓呂Eq|i3ujj&u|：您spg&cnuzGLQizbpX卜耳匕關12：V|日UUJLlfX

12、b|OLGLQOUf.GHV|E睨眾闪nSLCS26,|Y|auEqf闵atvn曲2&gc;gsdrsuc囲+甲mUGlfGdlGOZGLCW匕戶cm恒jusyb|9uj:n&uKH+M3L+闻X阴翠CU|hpnfcm然后我们就把大肠杆菌的：出现下图的对话框，点击匚聊|gqfj毋gjcp忧乳山皿昌pedn=ucGLQpbpA卜ejb这个序列进行比对。的序列及其他细菌的序列上传,，选择下拉对话框的eiipseeT12取哄北门rsizrE?gTIHuS=eB7AT=D=GTS=g!pnDUVSEdreLCBSpUwJ3LjC|Jip&2JVI加jELfsqip&z囲+-I潜LCflL山吐FE!段如

13、+FJyno-yi(39b?gC&efm圉石中驴2盘划別pX嗽叫:网細加內忙纠&二Fh理加M即缈m:mq二呵C13ifri?Ml1111Trm11111111111rr呼111111111111111lTll工pull吒叩PPfc次“匸工池iiiiiiiiniiiiiiiniiiiiiiinril|C|CZBC|Ctf|CC2YYCiCBl|C77|L(这是对五条序列进行比对的结果，每种碱基软件会默认标记一种颜色，下图显示是这五种细菌基序列很保守。的保守区。从这个图上我们可以看出，在这段区域内碱?Jrrrrr卜*gGezjsaTOGiiLyfiLCeEceeecJEqvyB|S|rB-yyfi

14、-CCiii|cz二叫勢怦卸匸他収肝血c雄瞪-卜卜卜卜卜D阳aedrsures小说|总缈aedrsjceg羁网2：p：3|CiUGL第三部分引物设计首先介绍一下关于设计的理论概念，基础法的方法也就是条引物的情况，从到一般有这样的一个靶序列人为的分成六个区域，命名为F3、123那它对应的互补序列我们就命名为F3、，针对这六个区域实际上我们是设计了四条引物，也就是内引物和I外引物和和的作用其实就相当于的上下游引物,它除了不断提供模板这样一个作用以外，它还可以反应之中起到置换和延伸而成的新链的作用。最关键的内引物实际上是由两部份组成的，是端是序列，的是序列，比较特这样一个序列。和殊的是在它们的5端人

15、为的加上了引物设计的关键因素有：值，引物末端的安定性，含量，引物间的距离，二级结构。首先，介绍值，值的定义是引物与模板完全结合的双螺旋结构降解一半时的温度，通常含量比较高的引物要求的值也较高；反应溶液里核苷酸的浓度越高，引物与模板越容易结合，值也越大；溶液中阳离子浓度越高，引物与模板的双链结构越稳定，值也就越高。中六条引物每条引物的值要求，不管是含量高还是含量高，引物和比其余几条引物的值要高上左右，这是为了在反应中能使和更加容易弯转，可以形成双茎环结构，具体参数如下图所示：n-re23-ejoC的TJCL3B320-ehcL5笳20-ejoCUC尺民.1口trrlc収一呱c1-丄山厶L丄LH.

16、亠-亠人A-rrsa-eijc第二点是引物末端的安定性，首先介绍变。我们指的/前提是模板和引物结合，把i个概念，也也就是吉这个作为一个化学反应，化学反应等号的左边是模板引物，右边是引物结合到模板上了。这样的话，如果/为负值的话，则该反应是能自由进行的，也就是我们的引物可以很轻松的结合在模板上。每条引物最末端的六个碱基我们计算出来的/值要小于等于，这个值是一个实验数据，/值越小，核苷酸越容易与模板退火结合。在这里遵循这样一个原则，即是的末端/值要小于等于，和的端的/值要小于等于第三点是关于含量，一般我们对引物的含量设定范围在:6之间。针对富含的序列，引物的含量一般会调整到5，0正%常的情况下6如

17、果是富含的话则在6之0间%。第四点时引物之间的距离，从端到端在之间，从的5端到的端也就是茎环这一段在之间，从的端到的端在之间。具体如下图所示:第五点是关于二级结构，特别要注意引物自身不能形成二级结构，因为二级idr1Lj结构不仅会影响反应效率同时也会导致一些非特异扩增。其中和引物可用其他引物软件再次进行分析确认。一定要确保引物的3末端没有错配，在是专门设置了参数。bUU)GLEXb|OLGLtHLlUdfilL|列鼬!训BlMfLiG(HWcrrwriDQCE1IONE2U，CSfifiuJnboure痂ELdhji社推加nsb岡賠C|即LH鏗QU帕诚1出偽5|1bUUI6LEXb|OlL3H

18、b阿卡幵4怪i.Laiu?QbLIUKLEXbplAgr1#*LaiflJW叩lupuztCbMf：f；AOnL|$8：b仲E加列蝕単创财中样护订刑bHP机E曲用WLSUOA$|6BIJG9Ujb|H|CB4|OULU聊曲eoMgieebec|C9|i401样蚪甘胡山凰EID|O谢IB9bLELUGLq|EUIUEHOME简单模式接下来具体介绍技术的引物设计，在线引物设计软件有两个版本，一个，一个4是较老的版本，版本更加智能化，所以下面所演示的引物设计实例都是使用的的版本。首先介绍下简单模式下的引物设计。打开m进入引物设计软件的界面，点击，上传靶序列。注意，这个软件运行需要安装一个软件，可以在

19、这个网站上下载，安装，软件才能正常运行。P:旳凹、：!肿旺历小:乍归冲扛阿玉邓罠吨圧FT迂J.OJLJJOUCKIS.列侣EUqJ229|!屈可貳陋7页面f馬至呼西jiZill旳甲迪甘nU.UUE日UVqgUUUGLl；林旺ESY.码.ZL|-LlJSt：3|ZL.D|K5G0、03q)=蛙点击，上传靶序列，这里靶序列的长度应该在之间，格式可以为、等。常规情况下，选择ST!冃Is沖w宙酣姫，常燜期w.ftiwECCKLSdJiCn?：J.JL3-tfi(wSmiJiftWOiiS站SSSSuK益厭窝SScST蟲mkjcJiSi忻時wGwKLtwefiflttsmtetfic:jawjc；ut_

20、也旳砧LiraCJGDBSUpEV81V2*併河M组引物。然后点击闭C-*-*,W7!-亠i*!H-!=J!*COKSEHSfl|wt|ENI；LJVJ誑并fljfl年叫1&啊*2押畤并r斗棉牺斗并曲琳枷髭竺春晒柬测聲戒IT養神卿X|i并附期訐篁故弹戸+岡氈殆碍呻T机机垮Strir*年起的材rnRcifi豐|啦?护哥钢网1llCG；DHV“切由取毋醐0仙：賦口加曲口用瞬-啊胆幌器iME帼I电MK睜CL；LL血甲LC3C：诞JC弐ELOWeieaeCl割甬唐!?!脚1丄卑世:卿LLClflOWGtCMllCUW橱CLELI5K：孕.|UMHBCJ：jt|IJEL-flfC-E祂1Dr|twpg-

21、u-pQiEp.uqIJ師磧咽b購诵貳Mb闿J1P卽亠唱IPH“厲浹qC*4J|d|x-i*jIKBI护5|,nEpQDU|h.pi|PUU)M.p|L-SV=E?.|CtHCV誉蛊I-jmuon|i.Gxidip畔wcifiai.洩*.*7店F-i或-iv可恥ftfanqbk!UKlYb|O4Cl沖Q在每组引物前的对话框中打钩，点击按钮，引物的详细信息则会出现在新的页面中。到这里引物设计的工作就完成了，接下来就是如何选择引物了。EJC商i.Q?3J-僭-匚占百ClJtlEUECXlE3it.頂W叫-Q20-EtOOKCCUC1C1U3C归?8i泓恫-Q-t33囚咋芒11战加JOQO83-QJ

22、O-toOE1rO材1貳山E1KC勺和1-时迸UC1强址11密th7.忧JX1史二曲芒11阿1换E3iEt305JOQO3J-QiO-130畑血5:洋止疣LC?Ci驗用囚书-3iQ-ra0K厲心隧J0C11二严韶兀3,tcs5U丄山网s.q;c:傘oeifIGMCGJ屯山外!Ji4i；q?TE匚bUUJBL|U|3LUJS；!DUfltqeLnBJtcJ8OQ-K130CClC?13CLLtfBi歆托皿-目一-eo?OQJCiOCCCEELjc.58OQ?ClCCJIlCl氏.20.门咒门巧-目亚-亦30色C?lJ0eil?EXClClCBl3c知如血忸强M阴迫屹船ElIG比牡JE臥训B3贴l

23、it闰-RM-?03叫MHJCC拠1裁席Lc.58.1?托门卫卫貂7书OQJ比HE述IF吒仰唯空3严泓丄山3,13C；：-?pOGiiG-iCB3DQq!联:山yiiiL用盘31bL岬L呵!MJBJC無-E书囚JlCJlKCEJldCBiJj33hti-內2托1述1UE1I廿UHLJC申31扫iJUci-3ic书匕wiECUXCEJJUe-同21冲JH山血山犬BD：7愤1吧1珈：1咼丹1啦皿ECH茅U13凌貝1训乃壮第UG4氓型山浪11魁B3W总圧曰2-3卫囚丸J加加贞汨：氏JLSJ2Uji诧讒嘶畅紐这里主要是依据第三部分开始的时候介绍的引物末端的吉布斯自由能变来选择。5冲qM列心巴炉一.住箕

24、这里遵循/的末端以及和的端的/值要小于等于原则，来选择引物。以上面的三组引物为例进行分析。从这个表中可以看到，第二组引物的末端的/值大于，所以这对引物应该舍弃，第一组和第三组引物可以用实验的方法进行筛选，选出最佳引物。专业模式如果在简单模式下无法得到引物或者得不到合适的引物，这时我们就可以使用专业模式进行引物设计。使用专业模式设计引物时，通常会出现很多条引物，因此需要对参数进行设定。D*l*l3*N!Ui$*曲亠阪阴QIWSiCiiffiK句KcsrxuwijqerpLBE|Mi(q2啊!1硝T辭刖!|醸-3Hl!CLIGtt)加1-电話?-制Tt503:-洋丄wtJCBJCfc:-fsj：t

25、afla；7;t?B5If:-11zru3ptMBJCSO7IMJ,宦汕第储ilCDtKIhlOU*1畑旳u*fypiiy|*!l_hHC3IJHJOAfi|l：bB32I&它!細3咅b声!16汇|!2卩p6|OiM呼|W|b3匚B32J典打3口B3甘肿朗Oticatw册3J皿i歸中&L|口feSf*宓口tlcM8-:口BJCMJCLt9常：633-IbtiifwuBsaytew:口pp|M|kigjKwjBJtJ博3.口flfgifnUQDUZGiLIEinE然后，点击按钮，就会出来很多引物，这时需要通过改变参数缩小引物组数，接下来具体讲解缩小引物组的原则。如果靶基因的含量在0正%常的范围的

26、情况下，可以把含量由默认的，5调%节到缩%小之间的上限距离。如果靶基因富含超过的情况下，可以把含量由默认的缩0小%到6值的设定,由默认的缩8小到，由默认的缩3小到如果靶基因富含含量小于45%，）可以把含量由默认的缩5小%到5值的设定,由默认的缩3小到，由2默认的缩8小到这里有一点需要注意大，家在缩小引物组的过程中要，小幅度的对参数进行调节，否则可能会出现没有引物出现的情况。如果我们将靶序列导入没，有引物产生，那么这时就需要放宽参数设定的范围。通用型引物和特异性引物的设计不管是通用型引物还是特异性引物的设计都需要对靶基因进行多序列比对，然后对序列进行手工改造，相同的碱基用“*”表示，不同的碱基用

27、“-”表示，缺失的碱基用表示。序列比对用、等软件。以为例，首先打开网页，在中选择T在中选择U然后选择，按照下图的格式上传或者直接粘贴到红色箭头指向的对话框当中。QLCllAGAeU5UJ6CDU(giUIUClAonLdfisiAb三皿!嗚VI!3LU.GJ；:LVaiWbbtfOXIWVlE空aroMVCCntTtflEon：bn:tcku.sf：二飞丄开亠C6U6L9|防甘中心网L9UJEpSI：然后我们需要对得到的比对结果进行手工改造，相同的碱基用“*”表示，不同的碱基用“-”表示，缺失的碱基用“.”表示，改造后的结果如下（只显示了部分序列）：比对结果如下图所示只显示了部分序列H|bwe

28、epojT口丁就3丁Hf55837-T珂旅电丁1OJ28-THOsseauTcrneivrwiWVLL1G3B1eceveeiivyiceyviivcieeeceifftfeeGCtfc&ceGCG3iiyYiitf7eiieeiGCWGzei-yic3eyyiiwcieeGCGifftfyccec?cecvGece3icicicsweiceei&cwezei丄旳i匚己岀理iiwcieecceifftfyccEcycecycccesiiieiifftfeicG3B1ecweeiivyiceyviivcieeeceifftfvecectfc&cveGcesi11eiisweiceei&cwGzeiiyic3eyyiiwcieesceiw-ccec?cecGece3iiiciitftfeic*=isvcciivGzeycewy&cyocseciwciz