人参水提物对β淀粉样蛋白诱导SHSY5Y细胞凋亡的保护作用

1、胡胜全余惠旻刘塔斯杨大坚陈新滋何翠君Keyrds：SH-SY5Yells；Aylidpeptide；EG；Apptsis阿尔茨海默症(AlzhEiersDisease，AD)，俗称老年痴呆症，为常见的中枢神经体系退行性疾病，是一种在正常意识状态下丧失智能本领的疾玻随着环球生齿老龄化的程度加速，AD等神经退行性疾病在老年人中的发病率居高不下，给社会和家庭带来了极重的包袱。由于AD发病机制庞大，如今临床用于治疗AD的药物均只对发病历程中的某一或某几个环节起效，但副作用大。中药由于在防治AD等老年性疾病方面有富厚的理论履历及毒性相对小等埋伏上风，越来越受到医学界的器重和推许。本课题选择包罗Rg1，R

2、b1等浩繁具有益智作用身分的人参，以中医药理论为引导，根据中药的传统煎煮法，制成水提物冻干粉，以A25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡作为神经元损伤的体外模子，不雅察人参水提物对神经元的庇护作用。1质料与要领1.1试剂A25-35(Siga公司)；1640造就基(Gibi公司)；FBS(Hylne公司)；Trypsin(Gibi公司)；TT(Siga公司)；DS(Siga公司)；Hehst33258(Fluka)；PI(Siga公司)；RNase(siga公司)；人参(深圳华辉药业，产地吉林，经湖南中医药大学药学院刘塔斯传授断定为人参)。1.2仪器2造就箱，美国Shellab；倒置荧光相差显微

3、镜，德国Leia公司(型号：D300)；超净事情台，ES公司；离心机，德国Hettih公司(型号：Rtfix32)；低温离心机，美国ulter公司(型号：AllegraT21R)；流式细胞仪，美国ulter公司(型号：EpisXL)；酶标仪，德国BG公司(型号：PlarstarGalaxy)。1.3药物制备1.4细胞造就及预处置惩罚SH-SY5Y细胞取自本实行室细胞库。用含有体积分数为10%的FBS，1%的NEAA非必须氨基酸的1640完全造就基，于37，5%的2孵箱中造就。4d举行1次传代，传代按13举行。取生恒久细胞举行实行。1.5实行分组将细胞分3组。正常比拟组：通例参加完全造就基；A2

4、5-35模子组：参加A25-35；EG庇护组：同时参加A25-35和差异浓度的EG。1.6不雅察指标和要领2效果2.1A诱导SH-SY5Y凋亡浓度和时间简直定镜下不雅察创造比拟组细胞形态正常，有显着的轴突图1a所示，而模子组细胞随时间推移和A25-35浓度升高，细胞损伤渐渐加强，胞浆黯淡，出现空泡和小斑点，轴突消散，细胞皱缩并聚拢成簇，各浓度在72h损伤严峻，出现细胞肿胀，胞膜破碎，胞内容物开释，包间沉积物聚拢图1b所示。流式检测创造，50l/LA25-35作用SH-SY5Y细胞72h后，凋亡率达(37.300.69)%，较比拟组有显着的统计学差异，Hehst33258染色也创造有蓝色的颗粒状

5、和固缩状荧光等典范的凋亡特性图1e所示。A25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的最正确浓度和时间为50l/L和72h。2.2EG对A诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响镜下不雅察创造A25-35和差异浓度的EG(1，5，10，15g/l)同时孵育SH-SY5Y细胞72h后，细胞形态都得到显着改进，胞浆匀称，大部门细胞出现轴突，细胞斑点和沉积物少。5，10，15g/lEG组较1g/lEG组抗凋亡作用更为显着图1所示。2.3效果各组细胞TT值如表1所示，与正常比拟组比拟，A25-35处置惩罚组A值明显低落(P0.01),A25-35和EG同时孵育后，A值明显升高(与模子组比力P0.05)，说明EG对

6、A25-35诱导的SH-SY5Y细胞损伤有显着的庇护作用。表1EG对A25-35引起的SH-SY5Y细胞毒性的细胞存活率的影响略与正常比拟组比力，#P0.01；与模子组比力，*P0.05，*P0.012.4Hehst33258的染色阐发效果如图1所示，正常比拟组细胞核出现布满匀称的低强度荧光图1d，而A25-35模子组细胞核呈浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光图1e，EG和A25-35同时给入细胞后，固缩形态和颗粒状荧光明显淘汰图1f。图1EG对A25-35引起的细胞形态和凋亡的庇护作用略2.5流式细胞仪DNA倍体阐发效果如图2和图3所示，50l/LA25-35作用SH-SY5Y细胞72h后，凋亡

7、率为(37.300.69)%，与比拟组1.560.80%比力，差异具有明显性意义P0.05，EG与50l/LA25-35配合孵育后，凋亡率随EG浓度升高而低落，1，5，10，15g/lEG作用于A25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡时，其凋亡率别离低落到(14.703.18)%，(7.231.51)%，(6.140.40)%和(5.881.33)%，与A25-35损伤组比力差异具有明显性差异P0.05。从细胞周期阐发(表2)来看，A25-35作用SH-SY5Y后，细胞周期产生了显着改变，除亚二倍体峰显着增长外，G0/G1和G2/期比例较比拟组下调显着。EG和A25-35配合孵育后，G0/G1期

8、细胞存活比例随浓度依靠性增长，S期细胞比例较模子组显着淘汰，说明EG对凋亡细胞的各个周期都有差异程度的停滞作用，其重要作用表如今G0/G1期。表2A25-35和/或EG作用SH-SY5Y细胞后细胞周期阐发略与正常比拟组比力，*P0.05；与模子组比力，*P0.05图2A25-35和差异浓度EG作用SH-SY5Y细胞后流式阐发略图3EG对A25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡的庇护作用略3讨论AD多发于老年人，临床表示为举行性影象力减退，认知成果停滞等，其病因和发病机制错综庞大，浩繁研究者从差异角度提出种种发病假说，如基因突变假说、氧化应激及快乐性毒性假说等，比年来，淀粉样卵白假说及其相干的凋亡

9、假说受到越来越多研究者的存眷，该学说以为A的聚拢在AD产生生长历程中起焦点作用，A引发神经元细胞的凋亡历程，导致神经细胞成果紊乱和殒命，终极引起痴呆，细胞过分凋亡大概是神经元退行性病变的缘故原由1，2。A是淀粉样卵白前体(APP)的一个3943个氨基酸片断，有神经毒性，包罗A25-35，A1-42，A1-40。此中A25-35代表了最具毒性A的生物活性片断3。本实行接纳A25-35作为神经细胞凋亡的诱导剂。人参是我国的传统中药，有大补元气、宁身益智、益气生津、补虚扶正、延年益寿之成果，被誉为“益气要药。当代研究证实，人参中的重要身分皂苷具有显着的促智作用46。但大多数研究均是以皂苷单体如Rg1,Rb2等作为研究工具7，8，本实行遵照中医药理论的团体治疗不雅，承袭中药的临床引导原那么，接纳传统煎煮要领，用人参水提物冻干粉作为研究工具，以A25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡做为AD模子，证实高浓度聚焦状的A25-35可诱导SH-SY5Y凋亡。而差异浓度的人参水提物可明显低落A25-35引起的高凋亡，对神经细胞有显着的庇护作用。在实行历程中，以往大多数研究先将药物预孵育，此后参加