瘦肉精ELISA法

1、克伦特罗检测（ELISA检测法）1克伦特罗ELISA检测试剂盒（北京华安麦科生物技术有限公司）2一、实验原理间接竞争ELISA方法，在酶标板孔条上预包被克伦特罗抗原，样本残留的克伦特罗和微孔条上预包被的抗原竞争抗克伦特罗抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物（标记物为辣根过氧化物酶）显色，样本吸光值与其残留物克伦特罗呈负相关，与标准曲线比较再乘以其相对应的稀释倍数，即可得出样品中克伦特罗的含量。3二、仪器、耗材、试剂仪器：微孔板酶标仪450/630nm、电子称、漩涡混合振荡器、离心机（15ml管和1.5ml ep管）、恒温培养箱耗材：小号研钵、15ml离心管、1.5ml ep管、（10-50ul、

2、50-250ul）微量移液器及配套枪头、3ml一次性吸管、酶标板架、滤纸4试剂：1M NaOH、组织样本提取液（80ml 25%甲醇+20ml 0.1M盐酸）克伦特罗酶标物、克伦特罗抗试剂、洗涤液（1:9体积稀释）底物A、底物B、终止液标准品：浓度为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ppb（十亿分之、10-9）对照品：浓度为100ppb5三、操作过程1、样品前处理2g肉，剪刀剪碎，研钵内研成匀浆6ml组织样本提取液，振荡器混匀4000r/min，10min；1ml上清+20ul 1M NaOH,混匀， 4000r/min，5min，20ul上清液用于分析6 2、分析微孔板编号， 如1-

3、6号标准品，8号样品等加标准品/样品：微孔中加入20ul样品或标准品+50ul克伦特罗酶标物+80ul克伦特罗抗试剂，轻轻振荡混匀，盖板膜盖板后，25避光30min洗板：孔内液体甩干，用洗涤工作液300ul/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干（若有未拍干的气泡用枪头戳破）显色：每孔加入50ul底物A+50ul底物B，轻轻振荡混匀，盖板膜盖板后，25避光15-20min（蓝色）测定：加入50ul终止液（黄色），轻轻振荡混匀。酶标仪450/630nm双波长检测（可在加入终止液前目测含量）7四、酶标仪使用1样品测试项目设置25438五、结果判定酶标仪采用对数回归计算法，得出样品液中瘦肉精

4、含量，最后通过计算得出样品中瘦肉精的含量猪肉中克伦特罗标准：加拿大和WHO是40ppb,而联合国粮农组织则是10ppb。中国、日本和新西兰规定该国生产不许使用，但进口猪肉中则允许有小于10ppb的残留。9六、注意事项1.试剂使用前要回复到室温否则影响结果（室温放置30min以上）2.洗版拍干后要立即进行下一步否则影响结果3.每加一种试剂前需轻轻摇匀4.终止液为2M浓硫酸，避免接触皮肤5. 0号标准的吸光值小于0.5时，试剂可能变质6.加入底物A和B显色放应，若颜色较浅，可延长反应时间到30min，反之则减少反应时间7.最佳反应温度是25，温度过高或过低将导致结果误差。10操作过程1、样品前处理2g肉，剪刀剪碎，研钵内研成匀浆6ml组织样本提取液，振荡器混匀4000r/min，10min；1ml上清+20ul 1M NaOH,混匀， 4000r/min，5min，20ul上清液用于分析 2、分析微孔板编号， 如1-6号标准品，8号样品等加标准品/样品：微孔中加入20ul样品或标准品+50ul克伦特罗酶标物+80ul克伦特罗抗试剂，轻轻振荡混匀，盖板膜盖板后，25避光30min洗板：孔内液体甩干，用洗涤工作液300ul/孔，充分洗涤5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干（若有未拍干的气泡用枪头戳破）显色：每孔加入50ul底物A+50ul底物B，轻轻振荡混匀，盖板