冻干黄热活疫苗制造及检定规程

1、冻干黄热活疫苗制造及检定规程本品系用减毒的黄热病毒17D株接种鸡胚，经研磨、离心，取上清液冻干制成。专供进入或经过黄热流行地区的人员预防黄热之用。1毒种1.1毒种来源减毒黄热病毒17D株。1.2毒种检定1.2.1无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。1.2.2纯毒试验用已知黄热病毒免疫血清做中和试验，证明其为黄热病毒。1.2.3猴体安全及效力试验取冻干黄热17D毒种，加无菌生理盐水恢复其原液量，接种无黄热病毒中和抗体之恒河猴10只，每只脑内注射0.25ml（50000个小白鼠LD50）。注射后第2、4、6日各采血1次，分离血清，分别做10倍系列稀释。以原血清及10-110-3各稀释度的血清分别脑

2、内注射体重1012g小白鼠6只，每只0.03ml，观察21天，检查病毒量，LD50均不得超过Log2（4天以内死亡的小白鼠不计算在内）。猴子经注射后24周，再采血1次，分离血清，做中和抗体测定。10只猴中至少要有9只血清表现阳性中和反应。在1个月的观察期中，发现脑炎症状或因而死亡者不得超过1只猴。1.3毒种保存原毒种和生产毒种批均应冻干后真空封口，保存于-70以下。1.4毒种传代和生产毒种的制备取毒种3支，启开安瓿后立即以稀释液（不应含有任何人体蛋白和外源血清或抗体）溶化。待全部溶化后接种于7日龄鸡胚卵黄囊，每胚0.2ml。分2组进行，每组不得少于10胚，置37.538培育。7080小时按组收

3、取活存鸡胚，每组不得少于4胚。去眼后分组混合研磨，加稀释液做成悬液，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，在鸡胚中传代，并抽样按生物制品无菌试验规程进行无菌试验。按同法连续传递2代，传代时可不等无菌试验结果，第3代毒种的鸡胚收获后，吸取容器内液体做无菌试验（方法同上），并将鸡胚冻存于-40以下。将无菌试验阴性之鸡胚取出融化。按每胚加入1ml稀释液研磨，经2000r/min离心10分钟，吸取上清液，加入稀释液稀释5倍后置冰浴中待用。同时做毒力滴定。此代即为生产毒种。2疫苗制造2.1接种鸡胚用7日龄鸡胚，每胚接种适当稀释度毒种液0.10.2ml于卵黄囊，接种后滴蜡封口。2.2培育接种后37

4、.538培育，7080小时开始收获。2.3收获收获时剔去死胚，分组收获活存鸡胚，去眼，装入大管中，逐管吸取管内液体做无菌试验，在操作过程中盛鸡胚之大管应置冰浴中保冷，收获完毕置-40冻存。2.4研磨、离心2.4.1研磨剔除洒菌鸡胚，将冰冻鸡胚大管置冷水中融化，倒入研磨桶内，按每胚1ml加入灭菌双蒸水，用电动研磨机8000r/min研磨3分钟。2.4.2离心，收取上清液将研磨后的鸡胚悬液以减压虹吸法分装于500ml瓶中，塞以胶塞，用2000r/min离心30分钟。离心应在25进行。收取上清液，每批装一个球瓶，换以胶塞，保存在冰浴中。2.5半成品检定2.5.1无菌试验按生物制品无菌试验规程进行2.

5、5.2冻干前病毒滴定吸取球瓶中样品，作10倍系列稀释。取10-110-6之病毒液，每个稀释度用体重1012g小白鼠6只，每只脑内注射0.03ml，接种部位忌用碘酒消毒，观察21天，计算LD50。2.6分装疫苗保存在冰浴中进行分装，每安瓿分装量为0.5ml（10人份）。分装后将盛安瓿之金属盒放入-40-50预冻2小时。2.7冻干全部冻干过程为1517小时，最后5小时升温2025，最高不得超过25。冻干后安瓿真空封口。3成品检定3.1物理检查外观为略带粉红色的疏松体，水分不应超过3%（g/g），加入稀释液应迅速溶解。3.2无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.3猴体安全及效力试验方法及要求见1.

6、2.3项，如生产毒种做过猴体安全及效力试验则疫苗可免做。3.4豚鼠安全试验按原分装量加入生理盐水溶解疫苗，用体重300500g豚鼠2只，试验前23天每天量体温、称体重。然后每只腹腔注射0.5ml，观察7天，每天量体温，应无病症发生。如2只豚鼠均有显著反应（体温超过40，体重减轻）或死亡，则该批疫苗应废弃；如有1只豚鼠有症症发生，可再用3只豚鼠重试，重试中如有2只以上豚鼠发病时，判为不合格，制品应废弃；如有1只发病，则再重试，仍有发病则判为不合格，制品应废弃。3.5病毒滴定同半成品检定。每只小白鼠脑内注射0.03ml。病毒滴度应3.66LogLD50。3.6稳定性试验由每批疫苗成品取3安瓿，置372周，滴度下降不应超过1Log