study-生技遗传学细菌和病毒的遗传分析

1、第六章细菌和病毒的遗传分析一细菌的特点1.是单细胞生物，结构简单，细胞一般较小，由一层或多层膜和壁所包围。2.平均每个细胞中有1-2条染色体，每条染色体附着在细胞膜上的一定区域，细菌的染色体大都是双链DNA分子所组成的一个封闭的环，染色体长度从250微米到35000微米不等，其染色体没有组Pr和其他Pr结合，不形成核小体结构。3.细菌染色体比较易于接受带有相同或不同物种的基因或DNA片段的插入。4.细菌繁殖能力强，世代间隔短，一般每20分钟分裂1次，在较短的时间内每个细胞的子细胞集合成群，可达到107 个细胞，成肉眼可以看到的菌落（称克隆）。5.易培养，易获动物各类突变型，便于遗传分析。第一节

2、细菌的特点二.大肠杆菌的实变型及其筛选1大肠杆菌的实变型分为三种类型：1.1 合成代谢功能的实变型，anabolic functional mutauts1.2 分解代谢功能的突变型catabolic functional mutants1.3 抗性突变型 （resistant mutants）1.1 合成代谢功能的实变型 anabolic functional mutauts合成代谢功能（anabolic functions）:野生型（即原养型）大肠杆菌在基本培养基上具有合成所有代谢和生长所必需的复杂有机物的功能，称合成代谢。营养缺陷型：某个或几个必需基因发生了突变使合成某种营养物质能力丧失

3、，从而阻碍整个合成代谢功能的实现，这种突变称营养型缺陷。营养缺陷型可通过在基本培养基上添加所需的有机成分使具有这种突变的细菌存活。一般营养缺陷型细菌的表型根据该菌株不能合成的物质来命名，取这一物质的前3个字母，第一个字母用大写表示，指出他们生长所需的物质，例如：Leu- Thr - Met- Bio- 表明这些突变品系分别需要亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸、生物素，而相应的原养型表型记作Leu+ 、 Thr+、Met+ 、 Bio+，而基因型3个字母都小写、斜体。1.2 分解代谢功能的突变型catabolic functional mutants分解代谢功能（catabolic function）

4、:野生型大肠杆菌能把复杂的糖类转化成葡萄糖或其他糖类，也能把复杂分子，如氨基酸或脂肪酸降解为乙酸或三羧酸循环的中间物，这种降解功能称分解代谢功能。降解功能相关基因发生突变从而影响降解功能的实现，这种突变型称分解代谢功能的突变型。例：Lac- 实变型不能分解乳糖，故不能生长在以乳糖为唯一碳源的基本培养基中，Lac+ 可利用乳糖。1.3 抗性突变型 （resistant mutants）细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌体产生抗性，这种突变称抗性突变。对T1噬菌体抗性表型记作Tr ，基因型ton- ,敏感表型记作TS 1 基因型ton+ ；对链霉素抗性表型记作Strr ,基因型str- ,每

5、2个表型记作Strs ,表型记作str+ 2.突变型筛选。不同的突变型采用不同的筛选手段。2.1营养缺陷型的筛选基本培养基：含水、无机盐和一般糖类及微量的生物素的培养基，野生型细菌可在基本培养基上生长完全培养基：在基本培养基上添加酵母和麦芽抽提物以及水解酪蛋白等的培养基，一般各种营养缺陷型菌株均可在完全培养基上生长1.将诱变剂如X射线，紫外线，或化学诱变剂等处理的细菌涂布在完全培养基上，通过细胞分裂，使各种突变型充分表现。2.待菌落出现以后，用印迹法（replica-plated method）把他们影印到基本培养基上，鉴定出不能生长的克隆。图示4-13.将鉴定出的不能在基本培养基上生长的克隆

6、再影印到只含一种氨基酸或维生素的培养基上，从而判定该突变型的营养缺陷类型。2.2分解代谢功能的突变型的筛选糖发酵性突变株lac- 选择，可将lac+和lac- 涂布于伊红美蓝培养基（EMB）上培养，lac+可形成有金属光泽的紫色菌落，而lac- 则形成白色菌落，容易识别。2.3抗性突变的筛把经过诱变处理的细菌细胞直接涂布到含有某种噬菌体或抗生素的培养基上，形成的菌落克隆就是抗性突变。对真核生物而言，遗传物质的交换，分离和独立分配机制形成重组体是通过减数分裂实现的，对于细菌而言，尚不具备真核生物配子进行融合的有性过程，它们重组体的出现单靠突变（10-4 10-10 ）不太理想，更重要的一个来源是

7、遗传物质从一个细胞传递到另一个细胞形成重组体。细菌获取外源DNA方式有4种：转化，接合，转导，性导下面我们分别来学习这4种方式，细菌遗传物质的交换过程，而且将利用这些方法作出细菌和噬菌体的染色体图。第二节 细菌转化转化：transformation 指某些细菌能通过其细胞膜摄取周围供体的染色体片段，并将外源DNA片段通过同源重组整合到自己的染色体的过程叫转化。转染（transfection）:是转化的一种特殊形式。用于原核细胞时其外源DNA是特指离体的噬菌体DNA，来感染感受态的细菌，并在其中得到表达。用于真核细胞时，对任何裸露DNA的吸收均称转染。一、转化现象的发现转化现象是在1928年首先

8、由格里费斯（Griffith）在肺炎双球菌实验中发现的，该菌的光滑型（S）菌株可引起人的肺炎及小鼠的败血症，粗糙型R不致病，实验过程见图示4-2说明S型细菌有一种物质或转化因素能够进入R型细菌，并引起稳定的遗传变异1944年Avery等不但成功重复了上述实现，而且在分子水平加以研究，证明转化因子是DNA，他们把DNA,Pr和荚膜（多糖类）物质从活S型细菌中抽提出来，把每一成份跟活的R型细菌混合，悬浮培养，结果发现只有DNA组分，能够把R型转化为S型，且DNA纯度愈高，转化过程愈有效。二、转化的过程动画4-11.供体DNA与受体细胞间的最初相互作用 这包括：转化片段的大小、形态、浓度和受体细胞的

9、生理状态，这些因素中最重要的是受体细胞生理上必须处于感受态（competence）即细胞处于能摄入核糖分子时的生理状态，一般用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性，因为野生型E.colio产生一种酶可迅速降解进入的外源DNA。2.转化DNA的摄取和整合包括供体DNA的结合和穿入，联会和整合，最后供体DNA的一条单链片段可通过重组而整合到受体DNA中2.1 供体DNA的结合与穿入（binding and penetration）当细菌处于感受态时，几个双链DNA分子可结合在受体细胞表面的几个接受座位上，接受座位饱和后，这些DNA随后纵长的被细菌所摄取，摄取时，由外切酶或DNA移位酶降解其

10、中一条链，并利用降解这条链产生的能量，将另一条链拉进细胞中。2.2联会（synasis）:供体的单链DNA片段进入细胞后和受体环状染色体的同源部分联会，形成三链结构。2.3 整合（integration）供体的单链DNA和受体双链DNA通过双交换进行重组，从而使供体DNA稳定地插入到受体DNA中，被取代的受体单链DNA不被降解。四通过转化作染色体连锁图原理如下：图4-3第三节 细菌的接合接合（conjugation）：通过细菌细胞间的直接接触，而发生的遗传信息从供体单向转移到受体的过程。一、Ecoli接合现象的发现Ecoli接合现象的发现是许多科学家不懈努力的结果。接合杂交实验1946年，黎德

11、伯格（Lederberg）和塔特姆（Tatum）发现大肠杆菌之间可通过接触交换遗传物质 见图示4-4A： 品系： met- bio- thi+ leu+ thr+B： 品系： met+ bio+ thi- leu- thr-A、B菌株在基本培养基上都不能生长A、B菌株混合培养在液体的完全培养基上，几小时后，把培养物离心，将沉淀细胞涂布在基本培养基上，结果长出一些原养型菌落：met+ bio+ thi+ leu+ thr+该实验巧妙之处在于：1）多重突变型（multiple auxotroph）品系排除了回复突变 2）用基本培养基来筛选原养型菌落这种原养型菌落的出现有2种可能性：（1）发生转化：

12、即其中一亲本的细胞在处理过程中发生破裂，释放出转化因子，和另一亲本重组产生部分的原养型。（2）这2种品系的细胞直接接触而发生了遗传物质的交换与重组，得到了原养型菌。到底是哪一种情况呢？年avis的型管实验巧妙的解决了这一问题。.型管实验图示4-5型管底部有一微孔滤板，可通过.微米以下的颗粒，细胞无法通过，即培养液和大分子可通过，将，品系分别放入型管的两侧，一侧塞上棉花，另一端接上注射器，当种细菌培养物都增生到饱和状态时，用注射器轻轻把培养液从一臂经过滤器吸到另一臂，再轻轻压过去，让培养物充分混合，但种品系的细胞无法接触，然后将两侧，菌株离心洗涤后再涂布到基本培养基上，都不出现菌落。这个实验非常

13、好的排除了转化的可能性，而清楚的表明两个亲本的细胞不互相接触是不可能进行杂交的，这为研究接合的本质奠定了基础。二、单向转移与F因子1.单向转移实验1952年Hayes在重复Lederberg和Fatum的杂交实验前，分别用高剂量的链霉素处理A品质和B品质，结果发现：这个实验说明，A，B两个品系在杂交过程中，作用是不相同的，A的基因转移到B，但B的基因不能转移A，因为链霉素可阻止细菌分裂，继而杀死细胞，但它允许交配持续一个短时间，A品系在杂交后被杀死，并不影响杂交结果，表明它是一种供体，象雄性动物一样，交配后被杀死，不会影响后代，而B品系像是一种受体，和雌性动物一样，受孕后被杀死，就无法产生后代

14、。Hayes的结论认为细菌有供体，受体之分，相当于雄性和雌性。F因子又称性因子（sex factor）或致育因子（fertilingFactor )，F因子结构包含了3个区域：（1）原点（origin）：转移的起点（2）致育基因（fertility factor）编码生成性伞毛即下纤毛的基因群，性伞毛即供体菌菌表面的管状结构，称为接合管（onjugutiontube ）（3）配对区（pairing region）:不止一个。2.F因子的结构 图 4-8三、高频重组品系和F因子F因子在菌体内存在方式有两种：1.自主状态存在 含有F因子的菌株记作F+ 菌株，无F因子的菌株记作F 菌株。当F因子以自

15、主状态存在时，F因子不依赖宿主染色体而独立地进行分裂，因此F因子的新拷贝能在接合过程中（F+ F ）转移到F 细胞中，把F 细胞转变成F+ 细胞，见动画4-22.整合至细菌的染色体组即Hfr，当F因子整合到细菌染色体时，F因子的繁殖与细菌染色体同步进行，当HfrF- 时，细菌基因的重组频率增加千倍之多，故这个品系称高频重组品系（High frequence bination ,Hfr）动画4-3。HfrF-中细菌染色体随着进入F- 细胞，一般在接合期间，Hfr细胞和F 细胞之间的接合管常会自发断裂，进入的Hfr染色体也随之断裂，这样HfrF- 杂交中选出的大多数重组子仍为F-.动画4-4。3.

16、部分二倍体Partial diploid F受体细胞只接受部分的供体染色体，这样的细胞称为部分二倍体。在这种部分二倍体细胞中，供体提供的部分基因组称外基因子（exogenote）,而受体提供完整的基因组，称内基因子（endogenote）,所以供体与受体的重组就是内基因子与外基因子之间的重组，这种重组不同于真核生物的完整二倍体重组。动画4-4四中断杂交与重组作图1中断杂交实验（interrupted mating experiment）是一种用来研究细菌接合过程中基因转移方式的实验方法。基本步骤是把接合中的细菌在不同时间取样，并把样品搅拌以中断接合中的细菌，然后分析受体细菌的基因型。将Hfr菌

17、株和F菌株混合在一起进行杂交培养。每隔一定时度取样，把菌液放在食物搅拌器内搅拌，以中断杂交，经过稀释，接种到含有链霉素的完全培养基上，这样将杀死所有Hfr细胞。然后对形成菌落的F- 细胞用影印培养法测试其基因型，以确定Hfr基因进入F 细胞的时间。见图4-9和表4-1从上图和表可看出，Hfr 菌株的基因是按一定的线性顺序依次进入F 菌株的，即染色体从原点开始以直线方式进入F 细胞，基因离原点愈近，进入F 细胞愈早，反之则晚。根据中断杂交实验，用Hfr基因在F 细胞中出现的时间为标准，做细菌的遗传连锁图。图4-10同一个Hfr菌株的转移起始点及转移顺序在不同的实验中是相同的，但是一个F+ 品系可

18、产生许多Hfr品系，因为F因子在细菌染色体上有许多插入位点，且插入取向不同而形成的，图4-11，用这些不同Hfr菌株进行中断杂交实验，则他们转移起点，基因转移顺序及转移方向都不同见表4-2。从表中可见每一基因两侧基因均是相同的，证实了大肠杆菌遗传图呈环状图4-12所示，Jacob和Wallman根据中断杂交实验所作大肠杆菌染色体图。2. 重组作图 bination mapping根据基因间重组率进行基因定位。在细菌的染色体作图中，基因距离较远用中断杂交作图有效，但基因距离较近时，基因间转移时间在两分钟之内 ，仅用中断杂交实验进行基因定位不够精确可靠，用重组作图来提高基因定位的精确性。第四节 F

19、因子与性导通过前面我们知道F因子可插入到细菌染色体中，形成Hfr菌株，科学家Adelberg 在1959年研究中发现，F因子也可通过规则的交换和剪切，从染色体上游离下来形成F+菌株，但是也会出现不规则的环出，形成F因子携带一段相邻的细菌染色体，我们称这种带有细菌染色体的F因子为F因子（Ffactor）。由于细菌染色体上插入位置不同而构成不同的Hfr品系，由此形成不同的F因子，它们各自携带细菌的不同基因。一F因子的形成见动画4-5二性导FF- F，F即F菌株即可转移F因子的拷贝至F 菌株，也可转移细菌染色体与F菌株染色体发生重组，将这种利用F因子将供体基因导入受体形成部分二倍体的过程称性导（se

20、xcluction ）。可通过分离大量不同的F因子进行了遗传图的识别。三三种不同致育因子的相互关系放在自我检测中第五节 噬菌体的遗传分析前面我们学习了细菌获取外源DNA的方式，即转化，接合，性导，细菌获取外源DNA的方式还有一种：转导。由于转导与噬菌体有关，所以我们放在噬菌体的遗传分析这部分讲。一噬菌体的基本知识噬菌体结构简单，没有一般的细胞结构，由核酸由Pr外壳构成，图示4131.噬菌体的类型：根据噬菌体感染细菌后能否将噬菌体裂解,可将噬菌体分为两类：烈性噬菌体（virulent phage）：可使宿主菌发生裂解的噬菌体，裂解过程见图示414：温和性噬菌体（temperate phage）：

21、噬菌体感染细菌后，细菌并不裂解，而以两种不同形式存在1）噬菌体的染色体通过交换整合到细菌染色体上，如入温和性噬菌体2）phage染色体能存在于细菌中，未发生整合。图示4-15溶源性lysogeny：某些细菌受到噬菌体的感染，并不立即导致溶菌，这种现象称溶源性，这样的细菌称为溶源性细菌或溶源菌。形成溶源性的原因：温和性噬菌体一般只有一个或少数基因表达，由此产生阻遏物可关闭其他基因的表达，使A噬菌体的核酸既不大量复制也不大量转录和翻译。溶源性可遗传：入噬菌体染色体随细菌染色体复制而复制，每个子细胞中有一个拷贝。P1噬菌体染色体的复制与细菌不同步，每个子细胞中至少有一个拷贝。溶源性噬菌体可通过诱变转

22、变为烈性噬菌体，这类诱导可造成阻遏物失活或稀释，促使噬菌体的其他基因表达，噬菌体大量繁殖使细胞裂解。二噬菌体的基因重组噬菌体非常小，只有在电镜下才能看到，如何研究它们的遗传重组？必须通过可见或检测的性状特征来研究。1.噬菌体可用于遗传研究的性状1.1 噬菌斑的形态噬菌体裂解细菌后，所释放的子代噬菌体感染邻近的细菌，使其裂解，释放的噬菌体再侵染其他细菌，这样在不长的时间内可形成大量的噬菌体的堆积，即噬菌斑（107 108 个），一个噬菌斑是由一个噬菌体起源的，在遗传上是均一的，相当于一个cloning。由于噬菌体基因不同，噬菌斑形态各异，或大或小，边缘清晰或模糊，如研究的广泛的T2噬菌体，野生型

23、r+噬菌体形成小而边缘模糊的噬菌斑，而突变型r噬菌体形成大而边缘清晰的噬菌斑，突变型r噬菌体裂解速度快称速溶菌突发型，不同速溶菌突变型在表型上不同，记作ra rb rc 等。1.2宿主范围：不同基因型的噬菌体能感染和裂解的菌株不同，T2噬菌体野生型h+可侵染裂解大肠杆菌B菌株，但不能侵染B/2菌株，而突变型h噬菌体可同时感染B、B/2菌株，如果把h+和h分别接种B和B/2的混合培养物上，形成的噬菌斑是不同的，对h+来说，形成半透明的噬菌斑，对h来说，形成透明的噬菌斑。2.噬菌体的遗传重组hr+与h+r型噬菌体同时侵染B菌株，为了测定在这个杂交中所得子代噬菌体的基因型，把释放出的子代噬菌体接种在

24、含有B及B/2菌株的培养基上，观察噬菌斑的形态，见图4-16。以重组值为图距绘制连锁图如果要绘制ra rb rc 及h的连锁图，用rx h+r+ h获得的实验结果见表4-3三、转导transduction以噬菌体为媒介所进行的细菌遗传物质重组的过程，即细菌的一段染色体被错误包装在噬菌体的蛋白质外壳内，并通过感染而转移到另一个受体细菌内。转导有2种：1）普通性转导（generalized transduction）即供体染色体上的任何部分均可被噬菌体携带转移至受体菌中。2）特异性转导（specialized transduction）即噬菌体只能携带供体菌的特异部分转移至受体菌中，又称局限性转导（restricted transduction）。1.转导现象的发现1951年Lederberg和Zinder首先在鼠伤寒沙门氏菌中发现转导现象。利用沙门氏菌的2个营养缺陷型杂