临床免疫学和免疫检验2017-全讲义

1、第十三章 免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。第一节 概述免疫组织化学的基本过程包括：抗原的提取与纯化；免疫动物或细胞融合，特异性抗体以及抗体的纯化；将标志物与抗体结合形成标记抗体；标本的处理与志物呈色反应；观察结果。；抗原抗体免疫学反应以及标一、标本的处理（一）标本的主要来源组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。减少对组织标本的损伤与挤压。体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂

2、片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织和在后续组织中的细胞结构和成分的改变。标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用或三氯化碳固定；如需除去的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用 10%固定或以微火加热固定；物（乙质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时

3、，需用醚、等）处理除去类脂。组织标本常规固定液为中性缓冲。3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。首选冷冻切片。其操作简便，可避免石蜡切片因固定（）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性。切片薄而有连续性，可长期保存。但对抗原的保存不如冷冻切片。二、抗原的保存与修复在制片过程中，由于广泛的蛋白交联可使组织中某些抗原决定簇发生遮蔽，致使抗原信号减弱或。因此，使组织抗原决定簇重新，即抗原修复是免疫组织化学技术中的重要步骤。常用的抗原、修复方法有：酶

4、消化法；盐酸水解法；微波法；高压锅法；煮沸法。三、抗体的处理与保存（一）抗体的选择：多克隆抗体广泛用于石蜡包埋的组织切片，假几率低，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反应。单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高。（二）抗体的稀释：抗原抗体反应要求有正确的比例，过量或不足均不能达到预期结果。故需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度。（三）抗体的保存：保存抗体时，要注意保持抗体的生物活性，防止抗体蛋白质变性，否则会降低抗体效价，甚至失效。四、免疫组化的结果判断（一）对照的设立：设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，主要针对第一抗体进行，常用的对照有阳性对照和对照。1.阳性对照 采用已知抗

5、原阳性的标本与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片的阳性将证明整个显色程序的正确。尤其在待检标本呈结果时，阳性对照尤为重要。2.对照 用确证不含已知抗原的标本作对照，结果呈。只有在对照成立时，方可判定检测结果。主要目的在于排除假阳性。（二）阳性结果：阳性细胞的显色分布有三种类型：细胞质；细胞核；细胞膜表面。免疫组织化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。（三）结果及抗原不表达：结果不能简单地认为具有否定意义，即使数细胞阳性（只要是在抗原所在部位）也应视为阳性表达。（四）特异性和非特异性显色的鉴别：特异性反应常分布于特定抗原部位，具有结构性，显色强度不一。非特异性

6、反应无一定的分布规律，常为切片边缘、刀痕或部位，坏死或挤压的细胞区域，常成片均匀。非特异性反应 由于细胞内抗原含量不同，特异性反应的显色强度不一。如果细胞之间显色强度相同或者细胞和周围结缔组织无明显区别的，常提示为非特异性反应。其他 在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性显色，有时可见非特异性显色和特异性显色同时存在，过强的非特异性显色背景可影响结果判断。（五）免疫组化结果与苏木素-时，应结合临床资料，如、染色（HE）切片结果：当免疫组化结果与 HE 切片不一致、部位、X 线等影像学及结果综合分析，不能简单地用免疫组化检查结果HE 切片。五、质量控制抗体的质量是免疫组化染色技术成功的关键

7、。使用前应了解第一抗体（即特异性抗体）和第二抗体（桥联抗体）的特异性和敏感性；通过预实验决定抗体的最佳稀释度；在已知阳性和的标本上观察实验结果的符合情况。试剂的质量控制包括合适的稀释度、稀释剂、孵育温度和时间等。操作过程质量控制1.实验操作 需严格按照标准化操作步骤进行，关注日间和操作间的变异情况。此外还应包括对试剂的复溶及试剂的有效性进行质量控制。直接染色法可选择空白试验和替代试验；间接法、三步法可采用替代试验和吸收试验进行质量控制。2.标本的质量控制 标本的留取、保存、固定和处理对免疫组化染色。用于质量控制的标本、操作过程、染色步骤、包括、阳性或自身组织对照三种类型。质控品的设置可有助于标

8、本试剂质量等问题引起的误差。有时需要对标本进行前处理，以消除内源性过氧化物酶的干扰。技术设备、仪器和器具的质量控制 需定期对相关设备、仪器（含基本实验液体）和器具进行校准。操作相关工具如吸管、试管、加样枪等需进行，以减少对抗体污染的机会。第二节 免疫荧光组织化学技术免疫荧光组织化学技术是采用荧光素标记的已知抗体（或抗原）作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原（或抗体），形成的抗原抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算其含量，以达到对抗原（或抗体）物质定位、定性和定量测定的目的。组织处理免疫荧光组化技术主要靠观察标本的荧光

9、抗体染色结果作为抗原的鉴定和定位，因此标本的制作十分重要。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和包埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中。标本要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。（一）标本的类型：基质标本是指固定在玻片上用作抗原的组织、细胞和微生物等，包括：1.涂片和印片：血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上，干燥固定后就可用于荧光抗体染色。脑脊液、脏器（肝、脾、淋鲜切面压印于玻片上做成印片，经固定后再染色。等）、细菌菌落或尸体病变组织可把新2.组织切片：最

10、常用。包括：冷冻切片：首选的制片方法。优点：操作简单，组织的抗原性保存好，自发荧光较少，特异荧光强，同时适用于不稳定的抗原；缺点：组织结构欠清晰；石蜡切片：形态学的主要制片方法，它不但是观察组织结构的理想方法，而且可进行回顾性。其优点是组织细胞的精细结构显现清楚，但对抗原的保存量不如冷冻切片，并有组织自发荧光和非特异性荧光，需加酶消化处理。3.细胞培养标本：细胞在玻片上培养，形成单层，固定后用作抗核抗体等检测的抗原片。还可使细胞单层生长在玻片上，再用或患者标本，然后固定，用荧光抗体染色法检测。4.活细胞染色：检查淋巴细胞表面抗原以及免疫球蛋白受体、癌细胞表面抗原、血清中抗癌细胞抗体等，均可用活

11、细胞荧光抗体染色法。当同时观察细胞表面两种抗原的分布和相互关系时，可行染色。（二）标本的保存标记标本在固定干燥后，最好立即进行荧光抗体染色及镜检。如必须保存时，则应保持干燥，置 4以下保存。一般细菌涂片或组织切片经固定后可保存 1 个月以上。但和某些组织抗原标本抗原性丧失很快，数天后就失去其抗原性，需在-20以下保存。第三节 酶免疫组织化学技术酶免疫组化技术是在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。一、组织处理主要用于标本中抗原（抗体）的定位和定性检测

12、。该技术染色标本可长期保存，可用普通光镜观察结果，可观察组织细胞的细微结构等优点，尤其是非标记抗体酶免疫组化法的敏感性更优于荧光免疫技术。酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。二、酶标记抗体免疫组化染色（一）直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。直接法的优点在于操作简便及特异性强，缺点是敏感性低，体种类有限。的抗（二）间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗

13、原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。间接法的优点是检测敏感性高，原或抗体。缺点是特异性不如直接法，而且操作较为繁琐。一种酶标二抗可用于检测多种抗三、非标记抗体免疫酶组化染色酶不是标记在抗体上，而是首先用酶免疫动物，效价高、特异性强的抗酶抗体，通过免疫学反应将抗酶抗体与组织抗原联系在一起。该方法避免了酶标记时对抗体的损伤，同时也提高了方法的敏感性。（一）酶：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色。酶较酶标法的敏感性有所提高，但操作分四步，较为复杂。在酶中，如果抗酶抗体与酶结合弱，在操作中酶

14、常被冲洗掉；如果酶标记在非特异性抗体上就会存在背景问题；如果抗酶抗体的非特异性成分与桥抗体结合，就会与抗酶抗体竞争桥抗体结合位点，影响方法的敏感性。（二）PAP 法：PAP 法是在酶基础上的改良。PAP 法首先将酶的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP 复合物）。该复合物由 2 个抗酶抗体和 3 个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与 PAP 复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同。与酶相比，PAP 法操作简便，分三步。PAP 复合物结构稳定，避免了酶中标记易脱落的弊端；敏感性高；背景

15、淡，因为即使桥抗体存在有非特异性抗体的可能，但因其与第一抗体并非同种属，故不能与抗酶抗体结合。并且，如果抗酶抗体中存在着非抗酶抗体，当其与桥抗体或组织成分结合时，由于其不能与酶结合，也不会产生非特异性反应。（三）双桥 PAP 法：在 PAP 法中通过两次连接桥抗体和 PAP 复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的 PAP 复合物于抗原分子上，以增强敏感性。这种放大方式重复使用桥抗体，使桥抗体与 PAP 复合物中抗酶抗体的未充分饱和 Fc 段结合，或桥抗体与特异性第一抗体尚未饱和的 Fc 段结合。（四）碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（APAAP 法） 辣根过氧化物酶（HRP）是免疫组化的首选用酶，但

16、有些组织细胞含内源性过氧化物酶限制了 HRP 的广泛应用，尽管用甲醇过氧化氢进行处理可以抑制内源性过氧化物酶活性，但同时也会影响抗原的显示。APAAP 法就是用碱性磷酸酶代替 HRP 建立的碱性磷酸酶（AP）-抗碱性磷酸酶（AAP）法，即简称 APAAP。其技术要点与 PAP 法相似。四、酶免疫组化染色中常用的酶及显色底物酶免疫组化技术中最常用的酶是辣根过氧化物酶，常用的供氢体有二氨基联苯胺（DAB），反应产物呈棕色；氨基乙基卡巴唑（AEC），反应产物呈橘红色；4-氯-1-萘酚，反应产物为灰蓝色。对含有丰富内源性过氧化物酶的组织切片（如淋巴组织和肿瘤组织），则首选 AP 标记的免疫组化方法。理

17、论上 AP 最为敏感，但 HRP 比 AP 染色结果保存时间长。第四节 亲和组织化学染色利用两种物质之间高度亲和性的特点，进行定位、定性或定量分析。广义的亲和组织化学包括：抗原与抗体、植物凝集素与糖类、生物素与亲和素、SPA 与 IgG、阳离子与阴离子、配体与受体等。此类方法具有高敏感性、操作简便、省时，可对抗原定性、定位或定量分析，具有准确、清晰等优点。一、生物素-亲和素法生物素即维生素H，是一种碱性蛋白。亲和素是由 4 个相同亚基组成的大分子糖蛋白，具有 4 个与生物素亲和力极高的结合位点。能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。此外，它们都具有与其他示踪剂结合的能力。常用的技术类型有：

18、（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术（ABC）原理：将亲和素与酶标生物素结合，形成可溶性亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）。当其与检测反应体系中的生物素化抗体（直接法）或生物素化第二抗体（间接法）相遇时，ABC 中未饱和的亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合，使抗原抗体反应体系与 ABC 标记体系连成一体进行检测。ABC 法的优点：生物素与亲和素的结合十分牢固，并且 1 个分子亲和素有 4 个生物素结合位点，可以分别和生物素化的抗体和酶结合，l 个过氧化物酶或免疫球蛋白分子又可结合多个生物素分子，从而形成网络状复合物。敏感性高、亲和力强、特异性高、第一抗体和第二抗体工作浓度低、

19、操作时间短、可以多重标记等。（二）桥联亲和素-生物素技术（BRAB 技术）以游离的亲和素作为桥联剂，将检测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素（如酶标生物素）联结起来，达到检测反应分子的目的。（三）标记亲和素-生物素技术（LAB 技术）以标记亲和素直接与免疫复合物中的生物素化抗体连接进行检测。该法具有相当高的灵敏度，由于省略了加标记生物素步骤，操作较 BRAB 法简便。间接 LAB 法采用的是生物素化的第二抗体，可以进一步提高检测灵敏度。二、葡萄球菌 A 蛋白法葡萄球菌蛋白 A（SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质，由于它独特的免疫学特性，目前已成为免疫学上一种极为有用的

20、工具。葡萄球菌 A 蛋白技术是根据 SPA 能与多种动物 IgG 的 Fc 段结合的原理，用 SPA 标志物（酶、荧光素、放射性物质等）显示抗原与抗体结合反应的免疫检测实验。SPA 常用 HRP 标记，可应用于间接法。SPA 法的染色程序基本同酶标抗体法，仅第二抗体改用 SPA-HRP。三、凝集素法凝集素（lectin）是一类从各种植物、无脊椎动物和较高等动物组织中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质。它可使红细胞凝集，故称凝集素。因此凝集素可以作为一种探针来胞膜的微小化合物结构，从而探索细胞的生物学结构和演变过程。细胞上的糖基，特别是细凝集素受体是存在于细胞膜上的糖蛋白和糖脂中的寡糖，其在胚胎不同发

21、育阶段、细胞成熟过程及代谢改变、细胞恶性转化等过程中都有不同程度的改变。其在肿瘤中对肿瘤细胞的以及良的分化都可以进行标记，凝集素是肿瘤细胞膜糖分子变化的一种理想工具。直接法：将标志物直接结合在凝集素上，使其与组织细胞相应的糖蛋白或糖脂相结合；间接法：先将凝集素与组织细胞膜糖基结合，然后再用标记的抗凝集素抗体（即用凝集素免疫动物抗凝集素抗体）与结合在细胞上的凝集素反应。间接法还有糖-凝集素-糖法，该方法是利用生物细胞膜的特殊糖基与凝集素结合后，再用标记的已知糖基与其反应，形成一个“三明治样”结合物。四、链和素-生物素法链和素（SA）是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，有 4 个生物素结合位点，并且

22、具有高度的亲和力。利用生物素结合的第二抗体与酶标记的链（LSAB）。和素蛋白就了酶标链和素-生物素方法LSAB 法是近年发展迅速的一种理想的亲合组织化学染色技术。具有以下特点：1.敏感性高 由于酶直接标记链和素，它与生物素结合的所有位点都呈游离状态，与 ABC 法相比，可结合的生物素化的第二抗体，因此放大效应远远超过 ABC 法。同时链和素分子量小，易于穿透组织、细胞，也可增强其敏感性。2.低背景链和素的等电点为 66.5，而亲和素的等电点为 10，因此 LSAB 法所带正电荷比ABC 复合物少得多，从而与组织内结缔组织的负电荷静电吸引少，明显减少非特异，染色背景清晰。3.第一抗体工作浓度低

23、与 ABC 法相比，其第一抗体的工作浓度更低，不仅节约了抗体，也明显降低了显色背景。4.操作简便 ABC 法的流程大约需近 100 分钟，而 LSAB 法加微波技术仅需 35 分钟，对于快速实用非常第五节 免疫标记电镜技术免疫电子显微镜（immunoelectron microscope ,IEM）技术是利用高电子密度的颗粒性标志物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物者如辣根过氧化物酶标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。 IEM 较之免疫组织化学在光镜下的定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器

24、，在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点。免疫标记电镜技术标本免疫标记电镜技术标本的要求：的要求是既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性，因此在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强，在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片免疫染色三种。一、免疫胶体金染色法：以胶体金作为示踪标志物，既可用于透射电镜（TEM）又可用于扫描电镜（SEM），其最大的优点就是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。在电镜水平，胶体金技术还可与其他技术结合，更充分地展示了它广泛的应用范围。如胶体金技术与冷冻蚀

25、刻技术结合，可对细胞膜不同膜蛋白颗粒或细胞膜表面的其他成分进行精细定位；与荧光技术结合，可将荧光素和胶体金同时结合于某种生物大分子，制成探针，同时进行荧光显微镜和电镜定位，使定位方便、准确，提高了工作效率；与分子杂交技术相结合，产生了电镜原位杂交技术，在超微结构水平上精确定位位点，为深入物体功能提供了有利的工具。二、免疫胶体铁细胞化学染色法：胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通过普鲁士蓝反应呈色，可用在电镜和光镜水平上的抗原（抗体）定位。三、酶免疫电镜技术：是利用酶的高效率催化作用，对其底物的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察，通过对酶的定位，对抗原（抗体）进行定位。第

26、六节 免疫组织化学技术的应用一、荧光免疫组织化学技术的应用（一）在自身免疫性疾病中的应用：自身免疫性疾病患者，检测组织中的自身抗体。补体荧光法等可检测免疫复合物沉积在组织础与程度极有帮助。细胞上的位置，对于了解肾小球性肾炎、类风湿关节炎病变和病变基（二）细菌和的快速鉴定：在细菌学方面，可用于双球菌、百日咳杆菌、螺旋体等的快速。免疫荧光技术在领域应用更为广泛，可用于和抗原在细胞内的定位，也可用于（三）、纤毛虫、过程的。的检测与：免疫荧光技术在方面应用极广，可用于疟原虫、利效果、钩虫、绦虫、蠕虫等的工作。近来在血吸虫及疟原虫方面较多，肯定。血吸虫抗原是用尾蚴和成虫，疟疾抗原采用的是的或实验动物的血清。二、酶免疫组织化学技术的应用1.提高病理准确性2.癌蛋白的临床应用对肿瘤细胞增