生物化学与分子生物学：DNA的生物合成-1

1、第三篇 基因信息的传递Genetic Information Transfer1基因的定义基因 (gene) 合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列。一般是DNA序列（或RNA病毒中的RNA）。2一个典型的真核基因：结构基因：外显子（编码序列）、内含子（非编码序列）及5-端和3-端非翻译区(UTR) 调控序列：通常位于转录起始点上游基因 结构基因 调控序列3基因组(genome)是指一种生物体中的整套遗传信息，一般为一个受精卵或一个体细胞的细胞核中所有DNA分子的总和。特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和。基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人的基因组的大小： 310

2、9bp4人类基因组特点20000 25000 蛋白编码基因及大量非编码的RNA基因，基因的分布不均匀 重复序列 40%蛋白编码区及非编码区均存在大量高度保守序列存在许多segmental duplications存在几百万个单核苷酸多态性（SNPs)位点，已发现 300万 500万个 SNPs56DNA的生物合成DNA复制的基本规律DNA复制的酶学DNA复制的一般过程逆转录和其他复制方式DNA损伤与修复7是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。复制亲代DNA子代DNADNA复制(DNA replication)81 DNA复制的基本规律半保留复制是DNA复制的基本特征双向复

3、制复制具有半不连续性DNA合成起始时需要引物复制具有高保真性91.1 半保留复制10平衡密度梯度离心Matthew Meselson & Franklin Stahl The Replication of DNA in Escherichia coli . Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1958 , 44: 671-68211 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从

4、新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念121.2 双向复制原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 证明双向复制的同位素标记试验13复制子(replicon)：从一个复制起始点开始的DNA复制区域。14真核染色体DNA复制时有多个复制起始点，形成多个复制子15(领头链）leading strand - continuous （滞后链）lagging strand. . . discontinuous 1.3 半不连续复制1617顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，

5、这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。 引物（Primer）：一段与模板链互补的短的核酸序列,通常是RNA ，其作用在于提供一个自由的 3-OH 与新掺入的脱氧核苷三磷酸的5磷酸基团反应生成新的磷酸二酯键。 1.4 DNA复制起始时需要引物18Nucleotides are added at the 3-end of the strand191.5 复制具有高保真性复制高保真性的原因：遵守严格的碱

6、基配对规律；复制出错时有即时的校读功能；DNA损伤修复机制；复制终止时RNA引物的切除及填补。Erroneous rate: 10-8 to 10-10 per base pair per round of replication202 DNA复制的酶学和拓扑学变化 DNA复制需要多种物质：底物：dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP)模板(template): 解开成单链的DNA母链引物(primer): 提供3-OH依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase, 简写为DNA-pol 或 DDDP)其他酶和蛋白质因子212.1 核苷酸

7、与核苷酸之间生成磷酸二酯键是复制的基本化学反应222.2 DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合DNA聚合酶的一般特征：需要引物 需要模板以四种 dNTP为底物5到3聚合活性（合成的新链与模板链反向互补 ）232.2.1 DNA 聚合酶(DNA pol)1958年由Arthur Kornberg首先发现的DNA聚合酶，又称Kornberg酶。245 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | |3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5外切酶活性 5 3外切酶活性?能切除突变的 DNA片段。辨认错配的碱基对，并将其水解

8、。该活性为即时校读（proofreading)功能所必需 DNA-pol还具有核酸外切酶活性 25DNA-pol的主要功能： 去除引物，填补引物消除后的空隙；对复制中的错误进行校读，填补修复中出现的空隙。262.2.2 DNA聚合酶1970年发现活性只有DNA-pol的5%此酶缺陷的大肠杆菌突变株的DNA复制都正常。可能在DNA的损伤修复中该酶起到一定的作用。272.2.3 DNA聚合酶III全酶（ polymerase III holoenzyme ）282.2.3 DNA聚合酶III全酶29“在伯格获奖十年之后，人们才知道，他所发现的DNA聚合酶并非细菌真正用于复制DNA的酶，在细胞内执行

9、这个任务的是另一种新发现的酶DNA聚合酶III。伯格的酶（被命名为DNA聚合酶I）只是在DNA复制中起修补作用（不过，这种酶后来在分子生物学研究和遗传工程中发挥了巨大的作用）。值得伯格欣慰的是，新的酶是他的二儿子托马斯科恩伯格在哥伦比亚大学读书时发现的。托马斯现在是加州大学旧金山分校的生物化学教授。 ”（方舟子博客：上阵父子兵）这一家人共发现了30多种酶。 伯格1975年写了一本书 “For the love of enzymes” （中译本：酶的情人：一位生物化学家的奥德赛）他的大儿子：Roger Kornberg won 2006 Nobel Prize in Chemistry for

10、his work in genetic research.302.2.4 真核生物的DNA聚合酶 统一采用希腊字母命名DNA-pol ：合成引物DNA-pol ：线粒体内DNA-pol ：负责后续链的合成DNA-pol ：修复核内DNADNA-pol ：负责前导链的合成31ThumbFingersPalm32解链过程中正超螺旋的形成2.3 复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化33DNA拓扑异构酶类型 底物例 子I A型单链DNA大肠杆菌拓扑酶I和III， 酵母和人类拓扑酶III，古细菌反向促旋酶I B型单链DNA真核生物拓扑酶 III型双链DNA大肠杆菌拓扑酶II（DNA促旋酶）和IV；真核生

11、物拓扑酶 IV34I型拓扑异构酶（Type I topoisomerase ） 切断DNA单链后再重新连接，不需ATP。II型拓扑异构酶（Type II topoisomerase ）切断DNA双链后再重新连接，需ATP DNA拓扑异构酶352.4 解螺旋酶解开DNA双链使成单链解螺旋酶(Helicase）即DnaB ，又称rep蛋白与复制相关的基因定名为dnaA, dnaB, dnaCdnaX。相应的蛋白质命名为DnaA, DnaB, DnaX等。362.5 单链DNA结合蛋白( Single-strand DNA-binding protein， SSB)372.6 引物合成酶 (Prim

12、ase)由大肠杆菌的dnaG基因编码的引物酶(primase)催化引物RNA分子的合成。382.7 DNA连接酶连接DNA双链中的单链缺口连接酶的特点：要求一条DNA链有3自由羟基而另一条链的5端有磷酸基团；只能连接双链DNA或DNA-RNA杂交双链中的单链缺口，但不适于双链RNA链中的单链缺口，也不适于单链DNA或RNA间的连接。39名称 功能DNA聚合酶 聚合脱氧核苷酸拓扑异构酶 理顺DNA链解螺旋酶(DnaB蛋白，rep蛋白) 解开DNA双链引物酶(DnaG蛋白) 催化RNA引物生成单链DNA结合蛋白（SSB） 稳定解开的单链DNA连接酶 连接冈崎片段参与复制的各种酶和蛋白质403 DN

13、A生物合成过程三个阶段: 起始 (Initiation ）延伸（ Elongation ）终止（ Termination ）41参与复制起始的各种蛋白质名称 功能DnaA蛋白 辨认起始点解螺旋酶(DnaB蛋白，rep蛋白) 解开DNA双链DnaC蛋白 协助解螺旋酶引物酶(DnaG蛋白) 催化RNA引物生成单链DNA结合蛋白（SSB） 稳定解开的单链拓扑异构酶 理顺DNA链42DNA复制起点双链解开；引发体(primosome)的生成；RNA引物的生成；DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3-OH末端。3.1 起始阶段43大肠杆菌复制起始模型44 Dna A Dna B、 Dna CD

14、NA拓扑异构酶引物酶SSB3535引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 45464748复制过程简图49DNA聚合酶 I催化切除冈崎片段上的RNA引物，并催化冈崎片段继续延长填补其缺口DNA连接酶将相邻的两个DNA片段连接起来，形成完整的DNA链终止区（terminus region） 核心序列：GTGTGGTGT复制的终止哺乳动物的细胞周期DNA合成期G1G2SM3.4.真核生物的DNA生物合成 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用

15、。 50起始、延伸和终止三个阶段多个复制子，复制起始点富含AT碱基复制中多种蛋白的作用类似原核DNA复制所需蛋白，但机制更为复杂复制过程涉及核小体的解体和重新生成，后续链中冈崎片段的长度就是一个核小体所含的DNA片段长度 真核生物DNA复制概况51 Pol （或Pol ） 填补冈崎片段之间的空隙 DNA连接酶 封闭缺口 RPA 稳定解旋后的单链DNA 解旋酶 复制叉的形成和移动必不可少拓扑异构酶 释放复制叉前进时产生的扭曲应力真核生物复制过程中的酶及功能52线性DNA分子如何避免每复制一次末端就缩短一次？53The Nobel Prize in Physiology or Medicine 200954真核生物的端粒和端粒酶端粒(telomere)： 真核生物染色体线性DNA末端结构，含DNA串联重复序列，与染色体的稳定有关。55端 粒“端粒之于染色体，好像鞋带两头儿的小塑料套和一根美丽鞋带的关系。如果没有小塑料套，由几股绳编起来的鞋带儿就要散架（下图）；同理，如果没有端粒，你的染色体就劈叉儿、磨秃。你说这么重要的东西值不值一个诺贝尔奖？”-摘自 “端粒，好好看住别丢了！”（/archives/21095.h