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文档简介
1、2016.8.112016.8.11刘亭刘亭报告内容报告内容 基因编辑简介基因编辑简介 CRISPR/Cas9 (2013CRISPR/Cas9 (2013,第三代基因编辑技术,目前最靠谱,第三代基因编辑技术,目前最靠谱) ) NgAgo-gDNANgAgo-gDNA(20162016,第四代基因编辑技术,还不靠谱?),第四代基因编辑技术,还不靠谱?) TELENTELEN(20112011,第二代基因编辑技术),第二代基因编辑技术) ZFNZFN (20012001,第一代基因编辑技术),第一代基因编辑技术) 四代基因编辑技术的比较四代基因编辑技术的比较 基因编辑技术的其它应用基因编辑技术的
2、其它应用基因编辑基因编辑 概念概念 对基因组进行人工定点修饰,包括敲除、敲减、插入、修正目的基因 意义意义 证明基因功能不可缺少的逻辑环节 基因工程和基因治疗的重要手段 技术技术 Suicide plasmid,RNAi,ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9,NgAgo-gDNA细菌的获得性免疫系统细菌的获得性免疫系统CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9TrancrRNA基因(Trans-activating crRNA)CRISPR基因 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 123N Cas基因
3、 (CRISPR-associated)Cas9 Cas1 Cas2 Csn2转录Pre-crRNA转录产脓链球菌(SF370)DNACas 蛋白翻译转录组合入侵的病毒或质粒 DNAPAM互补配对剪切扫描入侵的病毒或质粒 DNA不能复制和整合剪切互补配对 TrancrRNA CCR5 Cas9转化T细胞,表达基因编辑工具基因编辑工具CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9T细胞基因组DNAPAM扫描CCR5CCR5基因突变Cas9剪断的基因基因突变基因突变非同源末端连接修复基因修正基因修正同源重组修复基因插入基因插入同源重组修复研究思路研究思路 Cas9很牛,但是也有弱点,如脱靶,gRN
4、A 发卡等,有没有比它还牛的? Argonautes有牛过Cas9 的潜力,来源广泛,几乎所有生物中都有,不像Cas9只存在原核生物里。某些Argonautes 可直接结合ssDNA在其引导下切割靶DNA,不像Cas9 需要gRNA-trancrRNA的二级结构才能结合gRNA发挥作用。Cas 9只能识别切割PAM域处的序列, Argonautes 没有这个限制。 TtAgo和PfAgo可体外结合5磷酸化 ssDNA切割与它有互补序列的靶DNA ,但是反应温度是65,限制了其在细胞体内的应用。 有没有其它同胞可以在37 左右其作用呢?NCBI blast找,找到一个候选的Ng-Ago。是嗜盐碱
5、杆菌中的一个基因。 理想的Argonautes 就是要有自己的个性,与Cas 9不同,如上所述,结合DNA而不是RNA,同时能有Cas9 一样的功能,体内体外都能编辑基因,不断能敲除还能敲入,并且是在37 左右。最好比cas9 更牛,不需要PAM,效率高并且不容易脱靶。Figure 1 Figure 1 NgAgo uses 5 phosphorylated ssDNA guides and cleaves DNA targets in vitro. Figure 2 Figure 2 NgAgo binds ssDNA guide in a oneguide-faithful manner.
6、Figure 3 Figure 3 NgAgo works as an endonuclease and can cleave DNA targets in vivo.Figure 4 Figure 4 NgAgo can make targeted double-strand breaks in mammalian genome. Figure 5 Figure 5 NgAgo can be used to edit mammalian genome.NgAgo-gDNANgAgo-gDNA系统优势系统优势 1.容错率低,错配一个碱基就明显影响了NgAgo的效率,而错配三个就不起作用了; 2
7、.5-p-ssDNA在哺乳动物内稀少,这也就决定了胞内不会有gDNA带着NgAgo乱搞; 3.NgAgo一旦与5-p-ssDNA结合就不会再与其他的5-p-ssDNA结合; 以上三条都是讲NgAgo脱靶效应低; 4.ssDNAs易于设计和合成,因为它不依赖于PAM序列,比较容易推广应用。TALEN(transcription activator-like effector nuclease)转录激活样效应因子核酸酶TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程确定靶点确定靶点1 选择目标基因外显子中相隔17-18bp的两段14-18bp序列作为靶点TALENTALEN基因敲除基本流程基因
8、敲除基本流程载体构建载体构建2.1 TAL靶点识别域的克隆构建TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程载体构建载体构建2.2 2.2 将将TALTAL靶点识别域克隆入特定的真核表达载体靶点识别域克隆入特定的真核表达载体TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程转化敲除基因转化敲除基因3 将重组真核表达质粒转入(卵)细胞以表达重组核酸酶,敲除基因TALENTALEN基因敲除基本流程基因敲除基本流程筛选突变体筛选突变体4. 4. 筛选突变体筛选突变体锌指核酸酶(锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease, ZFNZinc-finger nuclease, ZFN)技
9、术)技术第一到第四代基因编辑技术的比较第一到第四代基因编辑技术的比较NgAgo-gDNANgAgo-gDNAgDNA脱氧核糖核苷酸Ago蛋白多位点编辑20bp双链断裂;单链缺刻非常容易?较轻?CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9技术应用技术应用不只是基因编辑不只是基因编辑 转录调控,表观修饰等 TrancrRNA GOI dCas9TALETALE技术应用技术应用不只是敲除不只是敲除 靶向基因敲除,敲入,转录调控,表观修饰靶向基因敲除,敲入,转录调控,表观修饰CRISPRCRISPR/ /Cas9Cas9研究历史研究历史p1987年,日本科学家在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现
10、串联间隔重复序列。p随后发现其广泛存在于细菌和古细菌的基因组中,2002年,正式将其命名为CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)成簇的规律间隔的短回文重复序列。p2005年西班牙科学家发现CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染色体外的遗传物质(如噬菌体基因组序列)高度同源,推测细菌可能通过CRISPR系统可能以类似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遗传物质的入侵。p2007年,Barrangou 等首次发现细菌可能利用CRSPR系统抵抗噬菌体入侵;2008年,Marraffini 等发现细菌CRISPR系统能阻止外源质粒的转移,首次利用实验验证了CRISPR系统的功能。p2012-2014年:Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier解释了CRISPR/Cas9系统的工作原理。理论上指向了一种全新的基因组编辑技术。p2013年初,麻省理工学院博德研究所的张
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