第二章 层析技术

1、chromatography 1第二章第二章 层析技术层析技术chromatography 2一一. 层析层析(Chromatography)技术的发展技术的发展1. 1903-1906，俄国植物学家，俄国植物学家M.Tswett系统提出层析法系统提出层析法chromatography 32.19312.1931年，年， Kuhn 用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体，显示了这一分离技术的高分辨力；种同分异构体，显示了这一分离技术的高分辨力；库恩，德国生物化学家（库恩，德国生物化学家（1900-1967）。）。库恩在研究中发现库恩在研究中发现8种类胡萝卜素，并制

2、种类胡萝卜素，并制纯品，确定其化学结构；与卡勒阐明了纯品，确定其化学结构；与卡勒阐明了核黄素的结构，并首次提纯了核黄素的结构，并首次提纯了1g核黄素；核黄素；与他人合作分离出维生素与他人合作分离出维生素B6。1938年，年，库恩因对类胡萝卜素和维生素的研究取库恩因对类胡萝卜素和维生素的研究取得成果而获得了诺贝尔化学奖。得成果而获得了诺贝尔化学奖。chromatography 4n英国生物学家英国生物学家Martin和和Synge首先提出了色谱塔板首先提出了色谱塔板理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，理论。这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评

3、价层以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程；析分离过程；n根据液液逆流萃取的原理，发明了液液分配色根据液液逆流萃取的原理，发明了液液分配色谱；谱；3. Martin和和Synge的工作的工作chromatography 5辛格辛格(Richard Synge)，英国，英国生物化学家。与马丁合作研究生物化学家。与马丁合作研究发明分配色谱，尤其是纸色谱，发明分配色谱，尤其是纸色谱，而共同获得而共同获得1952年诺贝尔化学年诺贝尔化学奖。辛格获奖时年仅奖。辛格获奖时年仅38岁。岁。马丁马丁(Archer Martin)，英国生化学家。，英国生化学家。与辛格合作研究发明了一种快速而又经

4、与辛格合作研究发明了一种快速而又经济的分析技术，即分配色谱，使化学、济的分析技术，即分配色谱，使化学、医学和生物学研究得到广泛的进展。和医学和生物学研究得到广泛的进展。和辛格共同获得辛格共同获得1952年诺贝尔化学奖，时年诺贝尔化学奖，时年年42岁。岁。1953年马丁和詹姆斯发明了气年马丁和詹姆斯发明了气体色谱法。体色谱法。chromatography 6塔板理论（塔板理论（plate theory）-柱分离效能指标柱分离效能指标n半经验理论半经验理论 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板

5、上的程分割成多次的平衡过程的重复（类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；平衡过程）；chromatography 7理论板数理论板数(n)：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流：在层析柱上，溶剂连续不断加入，化合物在流动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板动相和固定相中不断分配平衡，所发生的平衡次数称为理论板数。数。chromatography 8n色谱柱长：色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：色谱柱的理论塔板数：n， 三者的关系为：三者的关系为： n = L / Hn单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高；单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高

6、；chromatography 9塔板理论的基本假设为：塔板理论的基本假设为：n色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡；n样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略；n流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积；n在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。chromatography 10特别是他们提出了远见卓识的特别是他们提出了远见卓识的预言预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；处；chromatogr

7、aphy 11二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论即增加了理论塔板数塔板数)，这将会大大提高分离效率。，这将会大大提高分离效率。chromatography 124. 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代色谱分析的建立色谱分析的建立chromatography 13chromatography 14二二.层析法分类层析法分类 色谱法色谱法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法平板色谱法平板色谱法柱色谱法柱色谱法薄薄层层色

8、色谱谱法法纸纸色色谱谱法法气气液液色色谱谱法法气气固固色色谱谱法法分分配配色色谱谱法法吸吸附附色色谱谱法法离离子子交交换换色色谱谱法法排排阻阻色色谱谱法法超临界流体色谱法超临界流体色谱法亲亲和和色色谱谱法法chromatography 15 1. 1. 根据固定相基质的形式分类根据固定相基质的形式分类n纸层析纸层析 （filter paper chromatography ）n薄层层析薄层层析 （thin layer chromatography，TLC）n柱层析柱层析 (column chromatography )chromatography 16chromatography 17chro

9、matography 18 2. 根据流动相的形式分类根据流动相的形式分类 n气相层析气相层析 （gas chromatography，GC ）n液相层析（液相层析（liquid chromatography，LC ）n超临界流体色谱超临界流体色谱（supercritical fluid chromatography，SFC ）chromatography 193. 根据分离的原理不同分类根据分离的原理不同分类n吸附层析吸附层析n分配层析分配层析n凝胶过滤层析凝胶过滤层析n离子交换层析离子交换层析n亲和层析（分离生物大分子最为有效的层析技术）亲和层析（分离生物大分子最为有效的层析技术）chro

10、matography 20三三. .层析的基本理论层析的基本理论 层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及层析法是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的生物学特性的不同不同，使它们在某种基质中移动速度，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。不同而进行分离和分析的方法。 chromatography 21n溶解度溶解度n吸附能力吸附能力n立体化学特性立体化学特性n分子的大小、带电情况分子的大小、带电情况n离子交换离子交换n亲和力亲和力n特异生物学反应特异生物学反应chromatography 22n是层析剂的一个基质；是层析剂的一个基质；n可以是固体物质（吸附剂，凝胶，离子

11、交换剂可以是固体物质（吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（固定在硅胶或纤维素等），也可以是液体物质（固定在硅胶或纤维素上的溶液）；上的溶液）；n这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用；溶解、交换等作用；n对层析的效果起着关键的作用；对层析的效果起着关键的作用；1. 固定相固定相chromatography 23n层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等都称为流个方向移动的液体、气体或超临界体等都称为流动相；动相；n柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层

12、析时称为展层柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂；剂；n是层析分离中的重要影响因素之一；是层析分离中的重要影响因素之一； 2. 流动相流动相chromatography 24n在一定的条件下，某种组分在固定相和流在一定的条件下，某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，常用动相中含量（浓度）的比值，常用K来表示；来表示； K=Cs / Cm Cs: 固定相中的浓度固定相中的浓度 Cm: 流动相中的浓度流动相中的浓度n是层析中分离纯化物质的主要依据；是层析中分离纯化物质的主要依据；3.分配系数分配系数chromatography 25分配系数主要与下列因素有关：分配系数主要与下列因素

13、有关： 被分离物质本身的性质；被分离物质本身的性质； 固定相和流动相的性质；固定相和流动相的性质； 层析柱的温度（成反比关系）；层析柱的温度（成反比关系）；K值相近物质？值相近物质？chromatography 264. 迁移率（比移值）迁移率（比移值） n一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用用Rf来表示，来表示，Rf 1；nK Rf ；K Rf n分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件；

14、用层析方法能否分离的先决条件；chromatography 275. 分辨率（或分离度）分辨率（或分离度）n表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度；表示两种洗脱曲线相邻的溶质相互分离的程度；n随理论塔板数的增加而增大；随理论塔板数的增加而增大；chromatography 286. 正相色谱和反相色谱正相色谱和反相色谱 n正相色谱：固定相的极性高于流动相的极性正相色谱：固定相的极性高于流动相的极性n反相色谱：固定相的极性低于流动相的极性反相色谱：固定相的极性低于流动相的极性n分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用正相色谱，而分离纯化极性小的有机分子（

15、有机酸、色谱，而分离纯化极性小的有机分子（有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱；醇、酚等）多采用反相色谱； chromatography 297. 操作容量（或交换容量）操作容量（或交换容量） n在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达在一定条件下，某种组分与基质（固定相）反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量；到平衡时，存在于基质上的饱和容量；n单位是单位是mmol/g (mg/g) 或或 mmol/ml (mg/ml)；n数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强；数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强；n同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的，同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同

16、的，这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多这主要是由于分子大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响；少、溶剂的性质等多种因素的影响；chromatography 30四四. .纸层析纸层析 (paper chromatography)n纸层析是最简单的液纸层析是最简单的液- -液相分液相分配层析；配层析；n纸上饱和水为层析的固定相纸上饱和水为层析的固定相, ,与固定相不相混溶的有机溶剂与固定相不相混溶的有机溶剂为流动相；为流动相；1. 概念概念chromatography 312. 实验操作实验操作n滤纸的选择滤纸的选择n展层剂的选择展层剂的选择n样品预处理样品预处理n

17、点样点样n饱和与展层饱和与展层n显色显色( (化学法化学法, ,物理法物理法) )nR Rf f值测定值测定n定量方法定量方法( (洗脱比色法洗脱比色法, ,斑点面积法斑点面积法) )chromatography 32chromatography 33chromatography 343. 影响纸层析迁移率影响纸层析迁移率Rf值的主要因素值的主要因素n样品本身的性质和结构样品本身的性质和结构n溶剂的性质溶剂的性质npHpH值值n温度温度n滤纸滤纸n展开方式展开方式chromatography 35chromatography 36五五. .薄层层析法薄层层析法( (thin-layer chr

18、omatography,TLC) ) n固体物质平铺在平板固体物质平铺在平板( (玻璃板玻璃板) )上作为层析介质；上作为层析介质；n作用机理包括吸附、分配、离子交换和分子排阻作用机理包括吸附、分配、离子交换和分子排阻等；等；n各种薄层层析均与其对应的柱层析原理相同；各种薄层层析均与其对应的柱层析原理相同；1. 概念概念chromatography 372 支持介质支持介质n硅胶硅胶n纤维素纤维素n凝胶凝胶n聚酰胺薄膜聚酰胺薄膜chromatography 383. 薄层层析分类薄层层析分类chromatography 39chromatography 404. 特点特点n优点：操作方便，设备

19、简单，分辨率比优点：操作方便，设备简单，分辨率比纸层析高纸层析高10-100倍；倍；n缺点：生物大分子分离效果不佳；缺点：生物大分子分离效果不佳；chromatography 41chromatography 42六六. .柱层析柱层析1. 柱层析的基本装置柱层析的基本装置 chromatography 43chromatography 44chromatography 45chromatography 46chromatography 472. 柱层析的基本操作柱层析的基本操作n均匀、不能分层、不能有气泡等；均匀、不能分层、不能有气泡等；n根据层析的基质和分离目的而定。一根据层析的基质和分离

20、目的而定。一般柱子的直径与长度比为般柱子的直径与长度比为1:10-50；凝；凝胶柱可以选胶柱可以选1:100-200；（1）装柱）装柱chromatography 48chromatography 49 将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶）在将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度（适当的溶剂或缓冲液中溶胀，并用适当浓度（0.5-1mol/L）的酸、碱）的酸、碱 、盐溶液洗涤处理，除去其表、盐溶液洗涤处理，除去其表面的杂质。然后用去离子水洗涤并真空抽气（吸面的杂质。然后用去离子水洗涤并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），除去其内部的气泡。附剂等与溶液混

21、合在一起），除去其内部的气泡。n柱材处理柱材处理n操作流程操作流程注意不能干柱、分层注意不能干柱、分层chromatography 50 平衡平衡n恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能恒定压力下走柱子，平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同；保持相同；n平衡液体积一般为平衡液体积一般为3-5倍柱床体积；倍柱床体积；n用蓝色葡聚糖用蓝色葡聚糖2000在恒压下走柱，如色带均匀下在恒压下走柱，如色带均匀下降，则说明柱子是均匀的；降，则说明柱子是均匀的；chromatography 51 加样加样n通常加样量应少于通常加样量应少于20%的操作容量；的操作容量；n加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表

22、面，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦；尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦；chromatography 52(4) 洗脱洗脱n简单洗脱简单洗脱 如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔不长，适合采用该法。其区带的洗脱时间间隔不长，适合采用该法。缺点：洗脱体积大，溶质洗脱不尽缺点：洗脱体积大，溶质洗脱不尽chromatography 53n分步洗脱分步洗脱 洗脱能力递增的几种洗脱液逐级洗脱。适合混合物组成洗脱能力递增的几种洗脱液逐级洗脱。适合混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离

23、时。每次用一种简单、各组分性质差异较大或需快速分离时。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。优点优点：无须特殊设备，操作简单；无须特殊设备，操作简单；缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容缺点：流动相浓度不断变化，易出现干扰峰，容易出现多组分洗脱峰重叠的现象；易出现多组分洗脱峰重叠的现象；chromatography 54n梯度洗脱梯度洗脱 适合混合物中组分复杂且性质差异较小时。适合混合物中组分复杂且性质差异较小时。其洗脱能力是逐步连续增加的。其洗脱能力是逐步连续增加的。优点：流动相优点：流动相I/pH 连续变化，不易出现干扰峰，操作范围广；连续变化

24、，不易出现干扰峰，操作范围广；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器；缺点：需要特殊的浓度梯度设备，如梯度混合器；chromatography 55 收集、鉴定及保存收集、鉴定及保存 基质的再生基质的再生chromatography 56七七. .凝胶柱层析凝胶柱层析（gel chromatography）n凝胶排阻层析、分子筛凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析；渗透层析；n以多孔性凝胶填料为固以多孔性凝胶填料为固定相；定相；n按分子大小顺序分离样按分子大小顺序分离样品中各个组分；品中各个组分；chromatography 57chromatography

25、 58chromatography 59chromatography 601. 概况概况n广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的应用于蛋白质分子量的测定测定、脱盐、样品浓缩等；、脱盐、样品浓缩等； chromatography 612. 凝胶层析测定蛋白质分子量原理凝胶层析测定蛋白质分子量原理n外水体积外水体积 (V0)-凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积；凝胶颗粒间液体流动相的体积；n内水体积内水体积 (Vi)-凝胶

26、颗粒中孔穴的体积；凝胶颗粒中孔穴的体积；n基质体积基质体积 (Vg)-凝胶颗粒实际骨架体积；凝胶颗粒实际骨架体积；chromatography 62n柱床体积柱床体积 (Vt)-指凝胶柱的总体积指凝胶柱的总体积 VtVoViVg 由于由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：相对很小，可以忽略不计，则有： VtVoVichromatography 63n洗脱体积洗脱体积 (Ve)-指将样品中某一组分洗脱下来所指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积；需洗脱液的体积；Ve一般介于一般介于Vo 和和Vt之间；之间；对于完全排阻的大分子：对于完全排阻的大分子：VeVo；对于完全渗透的小分子，对于完全渗

27、透的小分子，VeVt；分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积介于二者之间；积介于二者之间； chromatography 64chromatography 65nVt可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定；然后测量水的体积来测定；nVo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，常用蓝色葡聚糖来测定，常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积作为测定外水体积的物质；的物质； chromatography 66n分配系数分配系数 -Kav (或

28、或 kd) 对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系；在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系；chromatography 67 对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，对于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系：与其分子量的对数成线性关系： Kavb lg MWc b、c为常数，为常数，MW为物质分子量为物质分子量 由于由于Ve和和Kav也成线性关系，所以：也成线性关系，所以： Veblg MWc b、 c为常数为常数chromatography 683. 排阻

29、极限排阻极限n不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量；不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量；n代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离；凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离；n例如例如Sephadex G-50的排阻极限为的排阻极限为30,000，表示分子，表示分子量大于量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来；脱出来；chromatography 694. 凝胶介质凝胶介质4.1 对介质的要求对介质的要求n亲水性高亲水性高n表面惰性，不发生

30、化学和物理变化表面惰性，不发生化学和物理变化n高稳定性，有较宽的高稳定性，有较宽的pH适应范围适应范围n具有一定的孔径分布具有一定的孔径分布n机械强度高，耐高压操作，寿命长机械强度高，耐高压操作，寿命长chromatography 70nSephadexnSuperose/-dexnSepharosenCellulosenTSKgel4.2 介质的类型介质的类型chromatography 71chromatography 72n 网孔大小取决于交联度，网孔大小取决于交联度，网状结构愈紧密，孔隙愈网状结构愈紧密，孔隙愈小，吸水后膨胀也愈小，小，吸水后膨胀也愈小，机械强度高，分离物质的机械强度高

31、，分离物质的分子量也小。分子量也小。n化学性质稳定化学性质稳定,不溶于水、不溶于水、盐、弱酸和碱盐、弱酸和碱, 耐热耐碱不耐热耐碱不耐酸；耐酸；nG类类Sephadex的型号表示的型号表示每克干凝胶吸水量每克干凝胶吸水量x10,如如G-50表示每克干凝胶吸水表示每克干凝胶吸水量为量为5ml；葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶chromatography 73n商品名商品名Sepharosen一种一种大孔凝胶大孔凝胶，其工作范围的下限几乎是，其工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限，可分离的上限，可分离MW40万以上万以上的物质；因的物质；因此可用来分离核酸及病毒；此可用来分离核酸及病毒；n不带电荷，不

32、受微生物作用而降解；对热不稳定，不带电荷，不受微生物作用而降解；对热不稳定，易受易受pH影响影响(只在只在pH4.5-9.0范围内稳定范围内稳定)；琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶chromatography 74n生物胶生物胶P （Bio-Gel P），由美国），由美国Bio-Rod生产，生产，从从P-2至至P-300共共10种。种。P 后面的数字再乘后面的数字再乘1000就就相当于该凝胶的排阻限度相当于该凝胶的排阻限度；n使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似，但化学性质使用范围及效果同葡聚糖凝胶相似，但化学性质较葡聚糖稳定，可在较葡聚糖稳定，可在pH2-11范围内使用；范围内使用；chromatograph

33、y 75chromatography 76n设备简单、操作方便；设备简单、操作方便；n凝胶本身不与样品发生化学反应；凝胶本身不与样品发生化学反应；n操作条件较温和；操作条件较温和；n样品得率高样品得率高, ,重复性好；重复性好；5. 特点特点5.1 优点优点chromatography 77n要求样品和洗脱液的粘度很低；要求样品和洗脱液的粘度很低；n凝胶颗粒凝胶颗粒网络孔径大小非常有限网络孔径大小非常有限，可被，可被 纯化物质纯化物质的分子量范围受到限制；的分子量范围受到限制；n凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，如芳香凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用，如芳香族化合物与脂蛋白等；族化合物与脂

34、蛋白等；5.2 缺点缺点chromatography 786. 凝胶层析的应用凝胶层析的应用n脱盐脱盐n分离提纯分离提纯n测定高分子物质的分子量测定高分子物质的分子量n高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩n蛋白质复性研究蛋白质复性研究chromatography 796.1 脱盐脱盐n高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析高分子溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。法除去，这一操作称为脱盐。n优点：优点： 操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性操作简便、快速、蛋白质和酶类等不易变性n适用的凝胶：适用的凝胶： SephadexG-10、15、25或或Bio-Gel-p-2

35、、4、6chromatography 806.2 分离提纯分离提纯6.3 测定高分子物质的分子量测定高分子物质的分子量chromatography 816.4 高分子溶液的浓缩高分子溶液的浓缩chromatography 826.5 蛋白质复性研究蛋白质复性研究chromatography 83chromatography 84八八. 离子交换柱层析离子交换柱层析 （Ion Exchange Chromatography, IEC） 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据离子交换层析是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子

36、进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。析方法。 chromatography 85碳质离子交换剂碳质离子交换剂有机合成离子交换剂有机合成离子交换剂 离子交换树脂离子交换树脂离子交换纤维素离子交换纤维素葡聚糖凝胶离子交换剂葡聚糖凝胶离子交换剂离子交换膜离子交换膜离子交换剂离子交换剂离子交换液离子交换液离子交换块离子交换块离离子子交交换换剂剂1. 离子交换剂的分类离子交换剂的分类 凡具有离子交换能力的物质均称为离子交换剂；凡具有离子交换能力的物质均称为离子交换剂；chromatography 86离子交换树脂离子交换树脂强酸性阳离子树

37、脂强酸性阳离子树脂 弱酸性阳离子树脂弱酸性阳离子树脂 强碱性阴离子树脂强碱性阴离子树脂 弱碱性阴离子树脂弱碱性阴离子树脂chromatography 87n根据离子交换剂的性能分为根据离子交换剂的性能分为:阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂两性离子交换剂两性离子交换剂吸附性交换剂吸附性交换剂选择性交换剂选择性交换剂氧化还原交换剂氧化还原交换剂chromatography 882.1 纤维素系列离子交换剂纤维素系列离子交换剂2.常用的离子交换剂常用的离子交换剂chromatography 89n开放性长链和松散的网状结构，使其实际交换容开放性长链和松散的网状结构，使其实际交换容量要

38、比离子交换树脂大的多；量要比离子交换树脂大的多；n亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太亲水性，对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢，不致引起生物大分子物质的变性和失活；牢，不致引起生物大分子物质的变性和失活； n回收率高回收率高 ；常用：常用：DEAE-纤维素（二乙基氨基纤维素）纤维素（二乙基氨基纤维素） CM-纤维素（羧甲基纤维素）纤维素（羧甲基纤维素）chromatography 902.2 葡聚糖葡聚糖chromatography 91n不会引起被分离物质的变性或失活不会引起被分离物质的变性或失活n非特异性吸附少非特异性吸附少n交换容量大交换容量大 优点：优点：chromatogr

39、aphy 922.3 琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂chromatography 93优点：优点：n对对pH及温度的变化均较及温度的变化均较稳定稳定，可在，可在pH310和和070范围内使用；范围内使用；n改变离子强度或改变离子强度或pH时，床体积变化不大；时，床体积变化不大；n流速快，流速快，分辨率高；分辨率高；n特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化特别适用于相对分子质量大的蛋白质和核酸等化合物的分离；合物的分离；chromatography 94nSource 系列离子交换剂系列离子交换剂 特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压低 阳

40、离子交换树脂阳离子交换树脂 S系列；阴离子交换树脂系列；阴离子交换树脂 Q系列系列nMonoBeads 系列离子交换剂（系列离子交换剂（Pharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和特点：介质为亲水性聚醚，具有和Source系列相同系列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为同样分为Q系列和系列和P系列系列chromatography 95阳离子交换剂阳离子交换剂强酸性，聚苯乙烯树脂强酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，羧甲基纤维素弱酸性，聚苯乙烯树脂弱酸性，聚苯乙烯树脂chromatography 96阴离子交换剂阴离子交换剂强碱性，

41、聚苯乙烯树脂强碱性，聚苯乙烯树脂弱碱性，二乙氨乙基纤维素弱碱性，二乙氨乙基纤维素chromatography 973.离子交换剂的配基离子交换剂的配基chromatography 984.离子交换剂的组成离子交换剂的组成n高分子聚合物基质高分子聚合物基质n电荷基团电荷基团n平衡离子平衡离子chromatography 99聚苯乙烯磺化型阳树脂的形成聚苯乙烯磺化型阳树脂的形成chromatography 1005. 离子交换反应离子交换反应n阳离子交换反应：阳离子交换反应： ( RX ) Y + A ( RX ) A + Y n阴离子交换反应：阴离子交换反应： ( RX ) Y + A ( RX

42、 ) A + Y chromatography 101chromatography 102chromatography 1036. 离子结合强度影响因素离子结合强度影响因素n离子交换剂的性质离子交换剂的性质n离子本身的性质离子本身的性质n离子强度离子强度npHn温度温度n溶剂组成溶剂组成chromatography 104n如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为：如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为： Li Na K Rb Cs ； Na Ca2 Al3 Ti4 ；chromatography 105chromatography 106氨基酸的离子交换分离原理氨基酸的离子交换分离原理chromato

43、graphy 107chromatography 108 以用阳离子交换剂分离蛋白质为例（以用阳离子交换剂分离蛋白质为例（pH一定）：一定）：npI pH时，能与阳离子交换剂结合；时，能与阳离子交换剂结合； 一般一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强；越大的蛋白与离子交换剂结合力越强；chromatography 1097. 基本操作基本操作chromatography 110chromatography 1117.1 离子交换剂的选择离子交换剂的选择n配基的选择配基的选择 一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂；弱碱型离子交换剂；chr

44、omatography 112n基质的选择基质的选择chromatography 113n颗粒大小颗粒大小chromatography 1147.2 离子交换剂的处理离子交换剂的处理n膨化膨化n水悬浮水悬浮n酸碱浸泡酸碱浸泡chromatography 1157.3 缓冲液的选择缓冲液的选择n保证各个待分离物质的稳定；保证各个待分离物质的稳定；n使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合，而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定；n注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合

45、力强的离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果；离子，否则会大大降低交换容量，影响分离效果；离子强度和离子强度和pH：chromatography 1167.4 层析柱的选择层析柱的选择n亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大 增加柱长为宜。柱的直径与高度比以增加柱长为宜。柱的直径与高度比以1：20左左右为宜；右为宜；n采用离子强度较大的梯度洗脱采用离子强度较大的梯度洗脱 选粗而短的柱子为宜；常用的柱高为选粗而短的柱子为宜；常用的柱高为15-20cmchromatography 1177.5 上样上样n样品应与起始缓冲液有样品应与起始缓冲液有相同的相同的pH

46、和离子强度和离子强度；n离子强度应低；离子强度应低；n不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去；不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去；n上样量要适当，通常上样量为交换剂交换总量的上样量要适当，通常上样量为交换剂交换总量的1-5；chromatography 1187.6 洗脱洗脱n改变溶液的改变溶液的pH或改变离子强度或改变离子强度 使用使用阴离子交换剂阴离子交换剂时，增加盐离子浓度则时，增加盐离子浓度则降低降低pH 使用使用阳离子交换剂阳离子交换剂时，增加盐离子浓度则时，增加盐离子浓度则升高升高pH n亲和洗脱亲和洗脱 目的蛋白与加入离子发生目的蛋白与加入离子发生特异性相互作用特异性

47、相互作用而被而被置换置换n添加置换添加置换 能能置换置换基质上基质上所有蛋白质所有蛋白质n洗脱方法洗脱方法 阶段洗脱和梯度洗脱阶段洗脱和梯度洗脱 chromatography 119n洗脱速度通常要保持洗脱速度通常要保持恒定恒定n洗脱速度慢比快的分辨率好洗脱速度慢比快的分辨率好7.7 洗脱速度洗脱速度7.8 洗脱液的监测收集及组分鉴定洗脱液的监测收集及组分鉴定n监测监测 紫外检测仪在紫外检测仪在280nm处观察洗脱液的光吸收；处观察洗脱液的光吸收；n收集收集 分布收集器收集分布收集器收集n鉴定鉴定 聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等；聚丙烯酰胺凝胶电泳、测定活性等；chromatography 1

48、207.9 离子交换剂的清洗、再生和保存离子交换剂的清洗、再生和保存n可溶于碱的污染物可溶于碱的污染物 0.1 mol/L NaOH洗涤，洗涤，Milli-Q纯化的蒸馏水纯化的蒸馏水洗涤，结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白洗涤，结合缓冲液洗涤可以除去诸如脂类、蛋白质和核酸这类的污染物；质和核酸这类的污染物；n对于疏水性污染物对于疏水性污染物 乙醇溶液（如乙醇溶液（如70%的乙醇）或非离子型的去的乙醇）或非离子型的去污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。污剂洗涤可以除去脂类和其他的疏水性物质。chromatography 121n再生再生 酸碱交替浸泡酸碱交替浸泡n保存保存 加入适当的防腐剂

49、（一般为加入适当的防腐剂（一般为0.02 %的叠氮的叠氮钠），钠），4C下保存；下保存；chromatography 122 离子交换层析是一种简单而有效的去除水离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法。中的杂质及各种离子的方法。 聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。硬水软化以及污水处理等方面。8. 离子交换层析的应用离子交换层析的应用8.1 水处理水处理chromatography 123 一般是将水依次通过一般是将水依次通过H H 型强阳离子交换剂，型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的

50、杂质；去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质；再通过再通过OHOH 型强阴离子交换剂，去除各种阴离子型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。就可以得到纯度较高的纯水。流程：流程：chromatography 1248.2 分离纯化小分子物质分离纯化小分子物质n无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化；的分离纯化；n例如对氨基酸的分析，使

51、用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在氨基酸混合液在pH 2-3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的的离子强度和再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH，这样各种氨基酸将以，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定；不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定；chromatography 125n链霉素链霉素：中性溶液中为三价正离子，用阳离子交换树脂提：中性溶液中为三价正离子，用阳离子交换树脂提取。条件：中性下选择钠型弱酸性树脂，并适当稀释吸附取。条件：中性下选择钠型弱酸性树脂，并适当

52、稀释吸附滤液，有利于吸附链霉素。用酸（滤液，有利于吸附链霉素。用酸（0.1-1mol/L）洗脱；）洗脱；n四环类抗生素四环类抗生素：当：当pHpK1时，成正离子，可用磺酸基树时，成正离子，可用磺酸基树脂吸附。洗脱剂为碱性缓冲液；脂吸附。洗脱剂为碱性缓冲液；n新霉素新霉素：六价碱性物质，用强酸或弱酸性树脂提取。用氨：六价碱性物质，用强酸或弱酸性树脂提取。用氨水可将新霉素从磺酸基树脂上洗脱；水可将新霉素从磺酸基树脂上洗脱；抗生素的分离抗生素的分离chromatography 1268.3 分离纯化生物大分子物质分离纯化生物大分子物质n依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化，是分离纯化依据物质的带电

53、性质的不同来进行分离纯化，是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段；蛋白质等生物大分子的一种重要手段；n由于生物样品中蛋白的复杂性，很难只经过一次离子交换由于生物样品中蛋白的复杂性，很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用；层析就达到高纯度，往往要与其它分离方法配合使用；chromatography 127chromatography 128九九. .亲和柱层析亲和柱层析（Affinity Chromatography） 亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力而进亲和层析是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。行分离的一种层析技术。chromatogr

54、aphy 129应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、 抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a. 待纯化分子和配体间具有亲和性待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadexchro

55、matography 130chromatography 131n酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；酶：底物、底物类似物、抑制剂、辅酶、金属离子；n抗体：抗原、病毒、细胞；抗体：抗原、病毒、细胞；n激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；激素、维生素：受体蛋白、载体蛋白；n外源凝集素外源凝集素(Lectin)：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细：多糖、糖蛋白、细胞表面受体蛋白、细胞；胞；n核酸核酸: 互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；互补碱基链段、组蛋白、核酸聚合酶、核酸结合蛋白；n细胞细胞: 细胞表面特异蛋白、外源凝集素。细胞表面特异蛋白、外源凝集素。亲和色谱中采用的生物

56、亲和关系亲和色谱中采用的生物亲和关系：chromatography 132chromatography 133chromatography 134chromatography 135chromatography 136chromatography 137chromatography 138十十. .气相色谱气相色谱(gas chromatography)n气相色谱是气相色谱是20世纪世纪50-60年代发展起来的一种高效，快速分年代发展起来的一种高效，快速分析方法；析方法；n分为填充柱气相色谱和毛细管气相色谱两类。前者的固定分为填充柱气相色谱和毛细管气相色谱两类。前者的固定相又可分为固体相又可分

57、为固体(吸附剂吸附剂)和液体两类；后者固定相是液体；和液体两类；后者固定相是液体；n凡用气相色谱测定的样品均需气化；凡用气相色谱测定的样品均需气化；chromatography 139chromatography 140Analysis of 13 component sugar mixturechromatography 141十一十一. .高效液相色谱高效液相色谱 （High Performance Liquid Chromatography，HPLC）n优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，优点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分

58、析高沸点、大分子、定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物；强极性、热稳定性差的化合物；n缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大缺点：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜；前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜；chromatography 142n高压输液系统高压输液系统n进样系统进样系统n分离系统分离系统n检测系统检测系统n记录系统记录系统 chromatography 143chr

59、omatography 144chromatography 145n最常用的最常用的“万能柱万能柱”填料为填料为“C18”，简称，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，ODS）；）；nC18是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化学分析工作中应用的最为广泛；能力，在生物化学分析工作中应用的最为广泛；11.1 固定相固定相chromatography 146采用采用 Agilent 1100 series 反向高效液相色谱，以反向高效液相色谱，以20l样品进样，样品进样，色谱检测条件为色谱检测条件为varian C18反向分析柱反向分析柱（250mm4.6mm5m），检测波长），检测波长274nm，流动相（，流动相（ 水：水：甲醇：乙腈甲醇：乙腈60%:16%:24%）流速）流速1ml/min，柱压约，柱压约260，柱，