紫杉醇的性质及色谱分析方法

1、 紫杉醇的性质及色谱分析方法 摘要 紫杉醇是从紫杉(Taxus brevifolia)树皮中所提得，是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物， 也是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。已成为目前全球销售量排名第一的抗肿瘤药物。综述紫杉醇的发现历史、来源、性质及色谱分析方法。 Abstract Paclitaxel is extracted from Taxus brevifolia bark,whichnot only is one of the plants of the genus Taxus chinensis complex secondary metaboli

2、tes, also is the only kind of antitumor drugs that can promote microtubule polymerization and stable microtubule polymerization till now. It has become the top sales in the worldwide . Review of Paclitaxel history, origin, nature and chromatographic methods. 关键词：发现历史； 来源； 性质； 紫杉醇； 色谱Keyword：Discover

3、y history; Source; Properties; Paclitaxel; The chromatographic1.紫杉醇简介：1.1发现历史1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。在筛选实验中，Wani和 Wall发现紫杉醇粗提物对离体培养的鼠肿瘤细胞有很高活性，并开始分离这种活性成份。由于该活性成份在植物中含量极低，直到1971年，他们才同杜克（Duke）大学的化学教授姆克法尔（Andre T. McPhail）合作，通过x-射线分

4、析确定了该活性成份的化学结构一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol）。1.2来源 由于野生红豆杉资源有限且紫杉醇含量极低，限制了紫杉醇制药业的发展，全世界紫杉醇的需求量约为4000公斤/年，而总产量只有到300-400公斤/年。所以，从天然的红豆杉中提取紫杉醇的方法远远不能满足人们对紫杉醇日益增长的需要。因此，采用各种手段积极寻求紫杉醇新药源生产途径，扩大紫杉醇原料供应能力，已成为紫杉醇产业发展的重点研究方向之一, 目前已取得了一定的进展, 其途径可归结为以下几种：1.2.2天然红豆杉植物提取 紫杉醇的最直接来源是对天然植物红豆杉属种树皮和叶片中中提取。但由于红豆杉数量极少,自身繁

5、殖率低，生长缓慢，且紫杉醇的含量又极低。在这种情况下，要获得足够的紫杉醇用于临床研究和基础研究，单纯靠从天然植物中提取必将给红豆杉属植物的在自然界中的生存带来极大的威胁。但由于从红豆杉中提取紫杉醇的工艺已经成熟且工业化。因此,人们可利用人工栽培的方法来解决天然资源不足的问题。规模化、集约化营造红豆杉人工原料林, 是目前解决紫杉醇原料短缺的最现实、最快捷解决紫杉醇原料紧缺的方法。近年来，我国红豆杉人工种植发展迅速，云南农科院高山经济植物所繁育了5万株，成活率达94.3%，湖南绥宁县林业局繁殖幼苗3000多株,现已移栽大田，黑龙江中医药大学人工育苗也获成功。人工植物栽培的成功,为紫杉醇的获取开辟了

6、广阔的前景1。据不完全统计, 我国现有红豆杉种植企业140多家, 现已在云南、福建、湖南、四川、黑龙江等地拥有一定规模的红豆杉种植基地, 种植面积近15万亩。红豆杉人工种植对保护野生资源和满足紫杉醇制药工业的发展发挥了积极的作用。1.2.3化学合成 紫杉醇的全合成1994年初,Holto和Nicolaou几乎同时宣告紫杉醇的全合成获得成功2-3。此后紫杉醇全合成又在不同的研究小组获得成功4-5，但由于紫杉醇是分子结构复杂的化合物,全合成途径都包括25-40步化学反应,合成路线极其复杂,反应条件极难控制，所用化学试剂昂贵且收率低, 产品成本极高、效率低，目前尚未进入产业化。1.2.

7、3.2 紫杉醇的半合成 半合成法指的是将红豆杉属植物中所含的紫杉醇类似物经过某些化学反应,将其转化为紫杉醇。目前紫杉醇半合成法是为从天然红豆杉针叶中提取分离10-去乙酰基巴卡亭III(10-deacetylbaccatin III)或巴卡亭III (baccatin III)原料, 通过选择性保护7位羟基, 然后再酰化10位羟基，得到7位保护的巴卡亭III, 然后与侧链缩合,最后去掉保护基团得到紫杉醇。由于10-去乙酰基巴卡亭III和巴卡亭III在红豆杉属植物枝叶中含量较高，而且红豆杉枝叶量大,再生能力强，为紫杉醇半合成提供了丰富的原料。现在紫杉醇的半合成方法已比较成熟，国外紫杉醇生产的主要企

8、业如美国Bristol-Myers Squibb Co.，现已利用半合成法进行工业化生产紫杉醇。目前,半合成紫杉醇被认为是除人工种植外,扩大紫杉醇来源的有效途径。半合成法可以更大限度地利用植物资源, 但与直接提取紫杉醇的办法并无本质上区别,需要消耗大量红豆杉树木，仍然不能从根本上解决植物资源的匮乏问题。1.2.4 植物组织细胞培养利用植物细胞培养法生产紫杉醇，是各种研究方向中十分有吸引力的一个方向，细胞培养能够连续均匀生产，受外界条件影响不大，而且可以在反应器中大规模培养，易于提高产量和进行产物的提取纯化。美国农业部于1991年就批准了Christen和 Gibson 等用细胞培养法生产紫杉醇

9、及其类似物的专利6-7。 1994年ESCAgenetics(CA, USA)也宣布用细胞培养的方法生产紫杉醇，用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮的2-5倍8，但这个工作的细节没有报道。中国的甘烦远等发现云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达到12 g/L，紫杉醇含量为0.119%，约为成年树树皮中含量的12倍，为栽培植株的40倍9，但未见实际应用的报道，短期内成功应用的可能性较小。目前，虽然红豆杉细胞培养生产紫杉醇取得了很大的进展，紫杉醇生物合成途径基本清楚，细胞的生长和紫杉醇的产量已基本得到解决，有的已经得到生物反应器放大阶段，如美国一公司现在已经完成4000 L的培养技术，正在进行2000

10、0 L规模的工业放大研究10，但植物细胞遗传与生理的不稳定性、细胞间的不一致性使得在培养工程中高产细胞系不能实现高产率，而且易发生遗传变异产生其它代谢产物。另外，植物细胞培养技术较复杂，对反应器要求较高，也阻碍了通过细胞培养工业化生产紫杉醇的实现11。1.2.5微生物发酵法1993 年 Stierle 与 Stroble 首次报道了从太平洋紫杉树中分离出 200 多个内生真菌，对培养产物运用了 TLC、HPLC、ELISA、MS 和同位素标记等多种手段分析研究，发现一个真菌新种在培养 3 周后具有稳定地产生紫杉醇的能力，被命名为Taxomyces andreanae，紫杉醇含量为 24-50

11、ng/L12, 随后一系列产紫杉醇内生真菌被分离到13-19，为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径。除已经报道的内生真菌外，加拿大的科研人员还从加拿大红豆杉(Taxuscanadensis)的针叶中分离出一株产紫杉醇的内生细菌 Brawinia taxi，其紫杉醇的产量为 200-1000 ng/L，该菌株已经被保存在 ATCC (American Type Culture Collection)，遗憾的是目前分离到的内生真菌紫杉醇产量都不高，尚达不到产业化的要求。但是真菌的遗传操作比植物更简单，通过发酵条件和应用现代生物技术，可望提高紫杉醇的产量，降低紫杉醇的价格来满足市场的需求。所

12、以筛选产高产紫杉醇内生真菌，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是目前解决药源问题的有效途径之一。1.2.6 从山榛等植物中提取紫杉醇榛子为桦木科(Bet ulaceae)、榛属(Coryl us linn), 坚果树种，世界有15个种, 广泛分布在亚洲、欧洲、北美洲的温带地区。被学术界确认的有9个种，即美洲榛(C.America)、欧洲榛(C. avellana)、土耳其榛(C. colurna)等。榛子原产于我国，我国北方主要有两个种，即平榛(C. heterophylla Fisch)和毛榛(C. mandshurica Maxim)，其分布范围广，遍布黄河、秦岭以北地区。1998年美国俄勒岗

13、大学化学系Angela Hoffman博士等人发现从欧洲榛子中可以提取紫杉醇，她们发现至少从12个榛子树中提取到紫杉醇，特别是Gasaway, Halls Giant, Lewis and Willamette这四个品种紫杉醇含量较高20-25。2006年意大利科学家Federica Bestoso等人也从欧洲榛子的愈伤组织提取到紫杉醇且在愈伤组织中紫杉醇水平与红豆杉相当26。尽管山榛中的紫杉醇含量只有红豆杉的1/10，但是山榛是被子植物，世界上被子植物的种类比裸子植物要大数百倍。另外，山榛生长十分迅速、资源极其丰富，且不怕任何病虫害，更可贵的是山榛不仅枝叶、树皮中能够分离出了紫杉烷和紫杉醇等

14、活性成分，它的果实-山榛子壳中也含有紫杉醇。他们的发现为紫杉醇药用新资源开发带来了新的希望，既可降低紫杉醇的价格，又有助于保护红豆杉这一珍稀植物资源。1999年美国科学家Roy Stahlhut等人从东非罗汉松(Podocarpaceae)中提取到紫杉醇，但含量较低(0.54 mg/kg 干重)27。张长河等对可能与红豆杉有共同的起源的三尖杉(Cephalotaxus fortunei Hook.F.)的当年生幼茎和未成熟假种皮诱导出愈伤组织，HPLC分析发现含有紫杉醇和合成紫杉醇的前体10-去乙酰基巴卡亭III等物质28。周荣汉等从白豆杉(Pseudotaxus chienii)中分离到了紫

15、杉醇和短叶醇的存在29。这些发现可望为扩大紫杉醇原料来源的途径之一。如果上述几种紫杉醇技术开发的成功，将可大大缓解人们对红豆杉的依赖，避免人为造成红豆杉属植物的物种的生存危机，有效降低紫杉醇应用成本，为临床的广泛应用提供可能。1.2.7 基因工程随着基因工程技术的飞速发展和广泛应用，利用现代生物技术提高植物或微生物中紫杉醇及其前体含量的研究成为近年来科研工作者研究的一个热点。将紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因(或转录因子)导入植物或微生物中，获得转基因的细胞系、组织、再生植株，转基因的真菌或细菌，并进行大规模的培养，有可能从根本上改变紫杉醇供应不足的局面，最终实现紫杉醇的商业化生产。利用基因工

16、程方法增加红豆杉中紫杉醇的含量取决于两个条件：一是分离红豆杉中与紫杉醇生物合成相关的酶和基因；二是红豆杉遗传转化和再生体系的建立。美国华盛顿州立大学的 Rodney Croteau 院士领导的研究小组对紫杉醇在植物体内合成代谢机制的研究已经取得一些重大意义的进展，目前除了有限的几步反应尚不清晰外，其中编码大部分催化反应的关键酶基因已经被克隆并做了功能验证30。 红豆杉遗传转化比较困难，目前为止还没有成功的再生植株文献报道。但在这方也取得了一些重要进展，Richard等1993年用发根农杆菌转化太平洋红豆杉获得发根并检测到了紫杉醇31。Ermanno等的专利则是用发根农杆菌ATCC15834转化

17、东北红豆杉叶片, 获得发根并提取到紫杉醇。但是这个专利没有透露发根生长状况和紫杉醇含量。Hamada等利用发根农杆菌转化红豆杉获得发根,发根中紫杉醇含量比愈伤组织中增加50倍32。黄遵锡等报道用发根农杆菌A4感染短叶红豆杉芽外植体,30-35天后诱导发根, 诱导率达到30%，红豆杉发根在无激素的B5培养液中悬浮培养20天，生物量增加9倍，是同等条件下短叶红豆杉愈伤组织的2.9倍33。Han等利用根癌农杆菌使太平洋红豆杉和欧洲红豆杉无菌茎段产生冠缨瘤，并用Southern杂交检测到T-DNA的存在，从而首次证明红豆杉可被农杆菌转化34。盛长忠等用土壤农杆菌C58感染东北红豆杉(T. cuspid

18、ate)的外植体、愈伤组织, 结果,处于对数生长期的愈伤组织感染5min时, 冠瘿诱导率较高35。罗建平等用根癌农杆菌T-DNA对云南红豆杉原生质体转化而实现插入诱变。所有这些研究结果为今后将目的基因导入红豆杉细胞奠定了一个良好的基础36。目前部分微生物全基因组测序的完成, 促使人们利用基因工程技术, 将合成紫杉醇的基因簇转移到宿主微生物里，实现工业化生产成为可能。Huang 等的研究报道将紫杉醇合成途径中编码三个酶异戊烯基焦磷酸(IPP)异构酶、香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合成酶和紫杉二烯(taxadiene)合成酶的基因转到大肠杆菌Escherichia coli.中，使之过量表达来合成

19、紫杉二烯一种非常重要的紫杉醇的前体物。结果表明，本不产紫杉二烯的 Escherichia coli.中紫杉二烯的产量达 1.3 mg/l37。最近，Jennewein 等(2005)报道，将红豆杉中的细胞色素 P450 还原酶与细胞色素 P450氧化酶基因转到酵母中共表达，均在转化菌中检测到了它们的活性38。1.3主要性质 【英文 名称】 Paclitaxel 【别 名】 泰素，紫素，特素 【化学名称】 5，20-环氧-1，2，4，7，10，13-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4，10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13（2R，3S）-N-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯【分 子 式】 【分 子 量】

20、853.92【CA S NO】 33069-62-4【产品来源】 为红豆杉科植物红豆杉的干燥根、枝叶以及树皮。【规格含量】 99.5%【物理性质】 白色结晶体粉末。无臭，无味。不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有机溶剂。2. 色谱分析方法2.1反相HPLC法分析红豆杉树皮和树叶中紫杉醇及其类似物含量的研究39色谱条件：(l)等梯度洗脱:流动相为乙睛+水(45+55),流量1.0ml/min,紫外227nm检测;每个样品的分析时间为20mim。(2)梯度洗脱:流动相A为乙睛+水(25+75),B为乙睛+水(60+40)。流量1.0ml/min,紫外227nm检测。梯度程序为:从0min到35min,B

21、的浓度从100%0%到;从35min到min,B的浓度保持在100%;从45min到46min,B的浓度从100%下降到O%,回到起始状态;继续洗脱10min至色潜柱平衡和基线稳定后进行下一次分析,整个分析时间约60min。2.2 高效液相色谱法测定南方红豆杉中紫杉醇的含量40 色谱条件: 色谱柱：Kromasil ODS C18色谱柱；流动相 ：水 - 甲醇 - 乙腈（40：30：30）；检测波长 ：227 nm ；流速为 1 mLmin-1；柱温为 35 ；进样量10 L。理论板数按紫杉醇峰计算不得低于 2 000。测定波长的确定 取紫杉醇对照品适量，加甲醇制成对照品溶液，置紫外分光光度计

22、记录紫外吸收图谱，结果显示在 227 nm 处有最大吸收。2.3高效液相色谱-质谱联用技术测定毛榛中的紫杉醇含量41色谱条件： 色谱柱：Waters XBridge C18高效液相色谱柱(250 mm×46mm，5m)；洗脱梯度：流动相A为甲醇乙腈混合溶液(甲醇+乙腈=1+1)，B为含01乙酸铵的水溶液。005min，90A，10B；3035 min，A相从90升至100；45min 90A，10B。流速为04 mL·min；进样量5斗L；柱温35。2.4苯基-硅胶色谱介质的合成及其在紫杉醇提纯中的应用42紫杉醇的定性定量分析:采用4.6mmi.d×250mm的C

23、18柱，流动相为甲醇-乙腈-水（体积比为25:45:30）溶液，等度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为227nm。用紫杉醇标准品对照定性，外标法定量。2.5 HPLC法测定加拿大紫杉中紫杉醇的含量43色谱条件： 色谱柱为Agilent ZOBAX C18(250×4.6mm，5m)；流动相：甲醇：水(65：35)；流速：lmLmin；检测波长：227nm；进样量：20L：柱温为室温。2.6 D4020大孔树脂提纯发酵液中紫杉醇的研究44采用高效液相法(HPLC)进行检测，色谱条件： 日本岛津HPLC 2010CHT高效液相色谱仪，固定相：VP-0DS(C18)柱(D 46 m

24、m x 150 mm；5m)；流动相：V(乙腈)：V(甲醇)：V(水)=35：20：45；体积流量07 mLmim检测波长227 rim；灵敏度：01AUFS；柱温35；进样量lOL。2.7 HPLC测定比较曼地亚红豆杉和南方红豆杉不同部位的紫杉醇含量45Chromatographic conditions: Chromatographic Colum: Phenomenex-C18( 250 mm×4.6mm,5m), flow rate: 0.8 mL/min, mobile phase:MeOH-water( gradient elution: 0 10 min, 65%met

25、hano;1325 min, 67% methano; 2675 min,100% methano;7680 min, 65% methanol), wave length: 227 nm, column temperature: 30e, injection volume: 20L.2.8 HPLC法测定南方红豆杉种子中紫杉醇的含量46色谱条件： 色谱柱：Whatman C18(250×4.6mm，5m).流动相：乙腈-水（35:65-80；20）梯度洗脱，运行时间30min。柱温：30。流速：1mL/min。紫杉醇检测波长为227nm。进样量为20L。2.9 HPLC法测定紫杉醇

26、血药浓度条件的筛选47色谱条件: 色谱柱：C18(150minx46mm，5m)；检测波长：227 nm；柱温：25 ；流速：10 mL·min-1；流动相：分别用甲醇一乙腈一水(16：40：44 V/v)，甲醇一乙腈一磷酸盐缓冲液(pH分别为3.0和4.0)(16：40：44V/v)，乙腈一磷酸水溶液(pH=3.0)(50：50V/v)和乙腈一磷酸盐缓冲液(pH=40)(50：50V/v)为流动相，比较紫杉醇、多西紫杉醇及地西泮的出峰时间和峰形以及三者的分离度。2.10 RPHPLC 法测定新乡种植红豆杉树皮中的紫杉醇48色谱条件: Agilent色谱柱(型号TCC18 250 m

27、m×46 mm，5 m)，流动相V(乙腈)：V(水)=50：50，流速1.0 mL/min，紫外检测波长227 nm；进样量为10L；柱温为35。2.11 SPE-HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量49色谱条件： 岛津HP 2010C高效液相色谱仪，VP-ODS C18柱(150mm ×46mm)；流动相为甲醇：(v)水：(v)：乙腈(v)=20：45：35；流速0.7mlmin，检测波长227 nm，灵敏度，01 AUFS，柱温35，进样量20L。2.12 高效液相色谱法测定不同生长年限南方红豆杉中紫杉醇的含量50色谱条件： 色谱柱为大连伊利特Hypersil BDS

28、 C18柱(200 mm×4.6mm，5 m)，流动相为甲醇一水(58：42)，流速10ml.min-1，检测波长为227nm，柱温为25。理论板数经紫杉醇峰计>3 000，与相邻杂质峰的分离度>15。2.13 云南红豆杉枝叶中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的测定51色谱条件: 色谱柱：Angilent Hypersil ODS2柱（46mm×250mm×5m）；流动相：甲醇-乙腈-水（20:30:50）；柱温：30：流速：1.0ml/min;检测波长：227nm；进样量：10L2.14 正相和反相柱层析组合分离纯化紫杉醇52色谱分析： 采用HPLC对紫杉醇进

29、行分析，检测波长为227nm，4.6mm×250mm的C18柱（BECKMAN公司），同溶剂洗脱（Isocratic elution),流动相为甲醇/乙腈/水（25:35:40），流速为1.0mL/min.2.15 正相色谱法分离纯化紫杉醇工艺过程的研究53分析检测用TLC法结合HPLC法， TLC法采用EMERCK公司生产的铝制60F254硅胶板，板上硅胶厚度0 . 2 mm，HPLC为岛津SCL14Avp液相色谱仪，检测器型号SPD10Avp .流动相（体积比）甲醇：水（65 ： 35），流速1 . 0 mL / min .2.17 中性氧化铝固相萃取-HPLC法测定紫杉醇含量5

30、4色谱条件: Hypersii C18柱（250mm × 4 . 6mm，5m）；流动相：甲醇-水-乙腈（22：45：33）；流速：1mL/ min；检测波长：230nm。2.18 紫杉醇高产菌发酵产物的分离、纯化和鉴定55 HPLC法测定纯度及含量: Waters1525液相色谱仪，大连依利特 C18 柱 (150mm×46mm，5 m)，流动相：甲醇一水(70：30)，流速 07mLmin，检测波长 227nm。3.结论 本文对紫杉醇进行了简单概述，介绍了紫杉醇的发现历史、来源、性质。并对相应的检识方法进行了简单介绍，同时，还对紫杉醇的分布及存在形式进行了简略描述。此外

31、，对紫杉醇的提取方式进行了一定的归纳，主要叙述了几种提取方法。最后，讨论了紫杉醇的色谱分析，主要高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法、固相萃取-高效液相色谱法、正相和反相柱层析组合法、反相高效液相色谱等几种方法进行了探讨。 References:1.王正平. 天然抗癌药物-紫杉醇. 应用科技, 2004, 31(1): 56-58.2.Nicolaou KC, Yang Z, Liu JJ, et al. Total synthesis of taxol. Nature, 367(6464):630-634.3. Holton RA, Somoza C, Kim HB, et al. Fi

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