实验目的与要求掌握石蜡切片制作的基本过程及其注意

1、一、实验目的与要求：一、实验目的与要求：二、实验材料和仪器：二、实验材料和仪器： 实验材料实验材料: : 向日葵幼茎、石蜡、酒精、二甲苯、番红向日葵幼茎、石蜡、酒精、二甲苯、番红/ /固固绿染色液等；实验仪器和器皿：石蜡切片机、展片机、染色绿染色液等；实验仪器和器皿：石蜡切片机、展片机、染色缸、载玻片、盖玻片等。缸、载玻片、盖玻片等。三、实验内容与方法：三、实验内容与方法： 1.1. 2.2.四、作业：四、作业：石蜡制片的基本步骤石蜡制片的基本步骤1.取材取材2.杀死与固定杀死与固定3.脱水脱水4.透明透明5.浸蜡与包埋浸蜡与包埋6.切片切片7.粘片与烤片粘片与烤片8.脱蜡与复水脱蜡与复水9.

2、染色染色10.切片脱水、透明和封固切片脱水、透明和封固1.取材取材 1.1 材料来源及部位。材料来源及部位。 种类种类 部位部位 发育阶段发育阶段 是观察横切面还是纵切面？是观察横切面还是纵切面？1.2 取材原则：取材原则： 动作：快，轻，用力均匀动作：快，轻，用力均匀 体积合适体积合适 刀要锋利刀要锋利2. 杀死与固定杀死与固定 目的目的-杀死各种酶，保持细胞的结构杀死各种酶，保持细胞的结构 固定液固定液 固定时间固定时间 固定后的处理固定后的处理 最常用的固定液为最常用的固定液为FAA。固定时间不受限制，短则。固定时间不受限制，短则 数小时，长可延至数月或数年。数小时，长可延至数月或数年。

3、 配方：配方： 50或或70酒精酒精 90毫升毫升 冰醋酸冰醋酸 5毫升毫升 福尔马林福尔马林 5毫升毫升 柔软材料用柔软材料用50酒精，坚硬材料用酒精，坚硬材料用70酒精配制。酒精配制。 卡诺氏卡诺氏(Carnoys)固定液：有极强的渗透力固定液：有极强的渗透力 固定根尖和花药只需固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好分钟，时间太长不好(不不能超一天能超一天)。 固定后用固定后用95酒精冲洗，在组织不能立即处理时，酒精冲洗，在组织不能立即处理时，需转入需转入70酒精中保存。配法有两种：酒精中保存。配法有两种： 固定组织时应注意：固定组织时应注意：保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理

4、。保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。组织块不易过大过厚，厚度必须控制在组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。以内。固定液必须有足够的量，一般大于组织固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。倍以上。抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。气泡的干扰。组织固定后的处理组织固定后的处理冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。色效果。材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使

5、材料经过固定后，需要保存下来以备利用，通常使用的保存剂是用的保存剂是70%70%的酒精溶液，可以使一般的材料的酒精溶液，可以使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。保存较长的时间而不至于变坏。通常在冰箱中通常在冰箱中4 4存放。存放。3. 3. 脱水脱水 水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。明剂进入。 凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒清洗。 酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混。为了避免组织材料的急剧收缩，应按从明剂相混。为

6、了避免组织材料的急剧收缩，应按从低浓度到高浓度递增的顺序进行低浓度到高浓度递增的顺序进行. 30%-50%-70%-85%-95%-100%- 100% 每步每步30-60分钟左右。分钟左右。要求及注意事项要求及注意事项 保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净。 不同大小的组织块脱水时间不同。不同大小的组织块脱水时间不同。 不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩）不能过度脱水（过久使组织变脆、收缩） 在在50%50%酒精中加入曙红，用于染色。酒精中加入曙红，用于染色。 材料可以放在材料可以放在7070酒精中保存。酒精中保存。 正丁醇、叔丁醇、丙酮及二

7、氧陆环等也可做脱水剂。正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧陆环等也可做脱水剂。4.4.透明透明 纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。明剂，透明剂浸渍过程称透明。 常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。各种透明剂均是石蜡的溶剂。 通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍通常组织先经纯酒精和透明

8、剂各半的混合液浸渍12小时，再转入纯透明剂中浸渍。小时，再转入纯透明剂中浸渍。 材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。的脱水剂中再次脱水（但是效果往往不好）。 透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小及组织特性而定。特性而定。5.5.浸蜡与包埋浸蜡与包埋 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石

9、蜡和二甲苯的等通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍量混合液浸渍1 12 2小时或者过夜，再先后移入熔化小时或者过夜，再先后移入熔化的石蜡液中浸渍几天。的石蜡液中浸渍几天。 浸蜡应在高于石蜡熔点浸蜡应在高于石蜡熔点33左右的温箱中进行，以左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。利石蜡浸入组织内。 石蜡熔点：石蜡熔点： 45-50 45-50 软蜡软蜡 55-60 55-60 硬蜡硬蜡材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋；材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋；切片较薄时（在切片较薄时（在8 8微米以下），用熔点较高的石蜡微米以下），用熔点较高的石蜡包埋；包埋；夏季采用熔点较高的石蜡（夏季

10、采用熔点较高的石蜡（56,5856,58）, ,冬季宜选用冬季宜选用熔点较低的石蜡（熔点较低的石蜡（52,5452,54）。）。 石蜡的处理：石蜡的处理：新蜡应溶一次，增加密度。新蜡应溶一次，增加密度。并用滤纸过滤去除杂质。并用滤纸过滤去除杂质。加加5%5%10%10%的蜂蜡的蜂蜡, ,增加石蜡的韧性。增加石蜡的韧性。反复溶的旧蜡包埋效果更好。反复溶的旧蜡包埋效果更好。 程序：在溶蜡箱中进行，程序：在溶蜡箱中进行，55-60，恒温。，恒温。 浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯浸蜡：二甲苯透明后的组织块在二甲苯石蜡（石蜡（1 1）中）中1次，在石蜡中次，在石蜡中2次，每次次，每次1-3天左右。天

11、左右。 包埋：在室温进行包埋：在室温进行6. 切片切片 包埋好的蜡块用刀片修包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形，粘于小成规整的梯形，粘于小木块上。木块上。 切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切切片刀的锐利与否、蜡块硬度适当都直接影响切片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬片质量，可用热水或冷水等方法适当改变蜡块硬度。度。 通常切片厚度为通常切片厚度为812微米，切出一片接一片的蜡微米，切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。带，用毛笔轻托轻放在纸上。7. 粘片与烤片粘片与烤片 用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中材料脱落。以

12、后操作中材料脱落。 在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片，在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片，至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分，至于展片台上铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入将载玻片放入42温箱中干燥。温箱中干燥。常用的粘片剂为郝伯特常用的粘片剂为郝伯特(Haupt) 粘贴剂：粘贴剂：甲液：明胶甲液：明胶 1克克 蒸馏水蒸馏水 100毫升毫升 甘油甘油 15毫升毫升 苯酚苯酚 2克克乙液：甲醛乙液：甲醛 4毫升毫升 蒸馏水蒸馏水 100毫升毫升8. 脱蜡及复水脱蜡及复水干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。液中进

13、行染色。用二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。用二甲苯脱蜡，再逐级经梯度酒精复水。 脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二脱蜡（溶蜡）：将切片上的石蜡溶去。一般都用二甲苯溶脱蜡。如果脱蜡不彻底，材料的染色就困难。甲苯溶脱蜡。如果脱蜡不彻底，材料的染色就困难。 复水：脱蜡后的材料从高浓度的酒精溶液（复水：脱蜡后的材料从高浓度的酒精溶液（100%）开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常是是30%酒精或水，使材料中的水分逐渐增加。如果酒精或水，使材料中的水分逐渐增加。如果不经过复水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料不经过复水，材料脱蜡后直接进入染

14、色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。将会严重变形，甚至难以染色。 顺序：顺序：二甲苯二甲苯1/2 二甲苯二甲苯+1/2纯酒精纯酒精100%酒精酒精95酒精酒精85酒精酒精70酒精酒精50酒精酒精30酒精酒精水水染色染色以上各级约需以上各级约需510分钟。分钟。9. 染色染色 染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的染色的目的是使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。颜色和足够强的差异以便于观察。 经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不经染色可显示细胞内不同的细胞器及内含物以及不同类型的细胞组织。同类型的细胞组织。 根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色根据观察要求及研究内容采用不同的染色剂及染色方法。方法。 番红与固绿染色法番红与固绿染色法 番红用番红用l的水溶液，固绿用的水溶液，固绿用0.5的酒精液的酒精液(用用95的酒精配制的酒精配制) 染色步骤如下：染色步骤如下： 10. 切片脱水、透明和封固切片脱水、透明和封固 染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，染色后的切片经梯度酒精脱水，二甲苯透明后，滴加适量（滴加适量（12滴）中性树胶，再将洁净盖玻片滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，进行封片。倾斜放下，进行封片。 封固剂：加拿大树胶（