细胞生物学实验课件：精子细胞学分析

1、精子细胞学分析精子细胞学分析低渗膨胀实验（低渗膨胀实验（HOS)HOS) 原理：原理：基于完整细胞膜半渗透性基于完整细胞膜半渗透性简单实验，其引起低渗状态下的精简单实验，其引起低渗状态下的精子膨胀，即当有水流入时细胞体积子膨胀，即当有水流入时细胞体积膨胀。膨胀。 结果分析：结果分析： 精子尾部肿胀率精子尾部肿胀率= =尾部肿胀数尾部肿胀数/ /精子计数的总数精子计数的总数 精液标本中有精液标本中有60%60%以上的精子出现尾部肿以上的精子出现尾部肿胀，则认为胀，则认为HOSHOS实验正常。如果尾部肿胀精实验正常。如果尾部肿胀精子数低于子数低于50%50%，该精液标本则被认为异常。，该精液标本则

2、被认为异常。 方法：方法：取新鲜精液一滴加伊红取新鲜精液一滴加伊红Y溶液一滴，溶液一滴，于玻片上混合染色于玻片上混合染色lmin后光镜检。后光镜检。精子存活率精子存活率 染色原理：染色原理： 精子存活率是采用染料对精子进行染精子存活率是采用染料对精子进行染色，根据精子是否着色判断精子的死活。色，根据精子是否着色判断精子的死活。一般精子死亡后，细胞通透性改变，易一般精子死亡后，细胞通透性改变，易于着色。于着色。 染料通过精子受损细胞膜将精子染染料通过精子受损细胞膜将精子染成红色，而结构完整的精子则不着色。成红色，而结构完整的精子则不着色。 染色方法：染色方法： 取新鲜精液一滴加伊红取新鲜精液一滴

3、加伊红Y Y溶液一滴，溶液一滴，于玻片上混合染色于玻片上混合染色lminlmin后光镜检查。后光镜检查。 结果判定：结果判定： 活精子不着色，死精子着红色活精子不着色，死精子着红色 精子活率（精子活率（% %）= =（活精子数（活精子数/ /计数精子数）计数精子数）100%100% 计数计数200200个精子，得出活精子百分数个精子，得出活精子百分数冷冻方法冷冻方法 冷冻原理冷冻原理 细胞在冷冻过程中会发生如下细胞在冷冻过程中会发生如下变化：当细胞被冷至变化：当细胞被冷至-5 时，因溶液中加有冷时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍冻保护剂而降低溶液的冰点，细胞内外溶液仍未

4、结冰；当被冷至未结冰；当被冷至-5-15之间时，细胞外溶之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细中的水分子具有更高的化学能。其结果是，细胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的胞内水分子为了和细胞外水分子保持化学能的平衡，会向细胞外流动。平衡，会向细胞外流动。 缓冻法缓冻法是目前成功精子低温保存常用方法，是目前成功精子低温保存常用方法，其原理是在精子冷冻过程中，随着温度不断下降，其原理是在精子冷冻过程中，随着温度不断下降

5、，细胞外液中水分结冰使溶液的浓度升高，细胞内细胞外液中水分结冰使溶液的浓度升高，细胞内水分通过细胞膜渗透至细胞外，导致自身不断脱水分通过细胞膜渗透至细胞外，导致自身不断脱水皱缩，从而减少胞内冰晶形成。缓冻法即将精水皱缩，从而减少胞内冰晶形成。缓冻法即将精液与保护剂混合后缓慢降温至液与保护剂混合后缓慢降温至24 (平均平均0.60.8 min),保持这一温度冷平衡约保持这一温度冷平衡约2060分钟，分钟，以以12 /min速率降至约速率降至约-30 ，再以，再以810 /分钟速率降至分钟速率降至-80 以下，然后直接浸泡于液氮以下，然后直接浸泡于液氮(-196 )中保存。中保存。 速冻法速冻法原

6、理是迅速跨过冰晶期，以原理是迅速跨过冰晶期，以减少冰晶对精子膜损伤作用。速冻法与减少冰晶对精子膜损伤作用。速冻法与缓冻法区别在于降温前期不做冷平衡，缓冻法区别在于降温前期不做冷平衡，利用液氮蒸汽直接降温，一般以利用液氮蒸汽直接降温，一般以24 /分钟速率降温至分钟速率降温至-30 后，再按缓冻法后，再按缓冻法步骤冻存。步骤冻存。 精液冷冻保护剂精液冷冻保护剂 主要作用是减少冷冻和主要作用是减少冷冻和解冻过程中细胞渗透性损伤和减少冰晶解冻过程中细胞渗透性损伤和减少冰晶形成，细胞得以在超低温条件下保存。形成，细胞得以在超低温条件下保存。主要分为渗透性保护剂主要分为渗透性保护剂(如甘油等如甘油等)和

7、非渗和非渗透性保护剂透性保护剂(如单糖、卵黄等如单糖、卵黄等)。 精子复温速率和复苏温度精子复温速率和复苏温度 复温速度越快越好。常规做法是在复温速度越快越好。常规做法是在37 水水浴中，于浴中，于12分钟内完成复苏。细胞内外不会分钟内完成复苏。细胞内外不会重新形成较大冰晶，也不会暴露在高浓度电解重新形成较大冰晶，也不会暴露在高浓度电解质溶液中过长时间，从而无冰晶损伤和溶质损质溶液中过长时间，从而无冰晶损伤和溶质损伤产生，冻存细胞经复苏后仍保持其正常结构伤产生，冻存细胞经复苏后仍保持其正常结构和功能。复温速度过慢，细胞内往往重新形成和功能。复温速度过慢，细胞内往往重新形成较大冰晶而导致细胞损伤

8、，复温时导致的细胞较大冰晶而导致细胞损伤，复温时导致的细胞损伤非常快，往往在极短时间内发生。损伤非常快，往往在极短时间内发生。 为减轻复温过程中冰晶及渗透肿胀对精子为减轻复温过程中冰晶及渗透肿胀对精子损害，复温速率一般要比冷却速率高得多，目损害，复温速率一般要比冷却速率高得多，目前常用精子复温方法多采用前常用精子复温方法多采用37 水浴复温和室水浴复温和室温复温两种。温复温两种。 治疗不育症治疗不育症 预防遗传病预防遗传病 提供提供“生殖保险生殖保险” ” 预防性传播性疾病预防性传播性疾病 开展低温生物学研究开展低温生物学研究冷冻技术应用冷冻技术应用 冷冻方法冷冻方法 将精液与保护剂按将精液与

9、保护剂按1:1混匀后装入冻存管，混匀后装入冻存管，封好放入布袋，直接放在液氮面上封好放入布袋，直接放在液氮面上20cm处，熏处，熏蒸蒸20分钟，然后侵入液氮里。分钟，然后侵入液氮里。 复苏方法复苏方法 将冻存的标本从液氮取出后直接放入将冻存的标本从液氮取出后直接放入37度水度水浴浴5分钟即可。分钟即可。精子形态分类精子形态分类 头部缺陷头部缺陷 颈部和中段缺陷颈部和中段缺陷 瑞氏染粉(伊红美蓝)是由伊红和美蓝混合组成的中性盐染料，其中伊红是酸性染料，美蓝是碱性染料。这两种有色离子可以与细胞蛋白质选择性的吸附进而使细胞呈现不同的着色，胞浆中的碱性蛋白与伊红结合称嗜酸物质，胞核的核蛋白和原始细胞胞

10、浆等酸性蛋白质与美蓝结合呈紫红色，称嗜碱物质。吉姆萨染色法对细胞核着色较好结构显示更清晰，而胞浆和中性颗粒则染色较差，两者混合染色可兼二者之长。通过此方法对精液涂片染色可清晰的观察精子形态和精子顶体。精子瑞氏-吉姆萨染色法实验步骤实验步骤 1. 精液液化后，取精液液化后，取10l涂片，晾干；涂片，晾干；95乙醇固定乙醇固定10min，晾干。，晾干。 2.瑞吉染液临用前按瑞吉染液临用前按9：1比例新鲜配制。比例新鲜配制。 3. 将固定涂片用瑞吉染液染色将固定涂片用瑞吉染液染色3060s，加，加等量磷酸盐缓冲液，染色等量磷酸盐缓冲液，染色58min。（滴染）。（滴染） 4. 流水冲洗后，染色片子置

11、流水冲洗后，染色片子置95乙醇中乙醇中24s，自然干燥后显微镜下观察。，自然干燥后显微镜下观察。Smear method：巴氏染色精子显微镜照片6巴氏染色精子显微镜照片7巴氏染色精子显微镜照片8巴氏染色精子显微镜照片9巴氏染色精子显微镜照片10 1. 低渗膨胀实验，低渗膨胀实验， 取新鲜精液取新鲜精液5ul加低渗伊红加低渗伊红Y溶液溶液5ul ，于玻片上混合染色，于玻片上混合染色lmin后光镜检。后光镜检。精子尾部精子尾部肿胀率肿胀率= =尾部肿胀数尾部肿胀数/ /精子计数的总数。精子计数的总数。精液标本中有精液标本中有60%60%以上的精子出现尾部肿胀，以上的精子出现尾部肿胀，则认为则认为H

12、OSHOS实验正常。实验正常。2.2.精子活率检测精子活率检测 取新鲜精液取新鲜精液5ul加伊红加伊红Y-NaCl溶液溶液5ul ，于玻片上混合染色，于玻片上混合染色lmin后光镜检。后光镜检。精子活率精子活率（% %）= =（活精子数（活精子数/ /计数精子数）计数精子数）100%100%。活精子不着色，死精子着红色活精子不着色，死精子着红色精子形态学检测精子形态学检测 1. 精液液化后，取精液液化后，取10l涂片，晾干；涂片，晾干；95乙醇固定乙醇固定10min，晾干。，晾干。 2. 将固定涂片用瑞吉染液染色将固定涂片用瑞吉染液染色3060s，加等量磷酸盐缓冲液，染色，加等量磷酸盐缓冲液，染色58min。（滴染）。（滴染） 3. 流水冲洗后