第三章-1DNA复制图

1、 第三章第三章 DNA复制复制 (DNA Replication) 第一节第一节 基本概念基本概念 第二节第二节 DNA复制的酶学复制的酶学 第三节第三节 原核生物原核生物DNA复制（复制（E.coli） 第四节第四节 真核生物真核生物DNA复制复制第五节第五节 DNA的损伤修复及突变的损伤修复及突变DNA 复制在细胞周期的复制在细胞周期的S期期一、一、DNA的半保留复制的半保留复制 （Semi-Conservation Replication） 1958 Meselson-stahl 设计的设计的CsCl超离心试验证实了超离心试验证实了 DNA复制的这一特性（复制的这一特性（P39）第一节第

2、一节 基本概念基本概念15N 标记实验标记实验 细胞生长在细胞生长在15N 标记培养基中标记培养基中 转入正常转入正常N源培养基中源培养基中 分离各代分离各代DNA 分析各代分析各代DNA的浮力密度的浮力密度15N 标记标记 DNA未标记未标记 DNA CsCL密度梯度离心密度梯度离心 浮力密度浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/mlReplication fork1、复制起点：富含、复制起点：富含AT & 发夹结构发夹结构 “呼吸作用呼吸作用”十分明显十分明显 许多酶的结合位许多酶的结合位点点AT rich复制叉（复

3、制叉（replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点即复制正在发生的位点 2、复制方向（复制过程的顺序性）、复制方向（复制过程的顺序性） 复制眼（复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的）：电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域形如一只眼睛复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子真核生物的多复制子 多个复制眼多个复制眼单、双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉单、双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉 单向复制单向复制 双向复制双向复制 复制的多模式复制的多模式 单单起点、起点、单单方

4、向方向（原核）（原核）多多起点、起点、单单方向方向（真核）（真核）单单起点、起点、双双方向（原核）方向（原核）多多起点、起点、双双方向（真核）方向（真核）（1）复制：复制：DNA在复制原点解开成单链，分别作在复制原点解开成单链，分别作为模板，各自合成互补链，出现为模板，各自合成互补链，出现2个叉状的生长点个叉状的生长点（2）共价延伸方式（）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复）或滚环式复 制（制（rolling circle replication） 由于复制时产生的滚环结由于复制时产生的滚环结 构形状象构形状象，又称，又称复制复制 病毒、细菌因子病毒、细菌因子

5、（3） 置换式置换式 （Displacement form ） 又称又称 D 环复制环复制 动物线粒体动物线粒体 DNA的复制方式的复制方式(P47) 其中其中 DNApol 全酶有十种共全酶有十种共22个亚基个亚基二聚体二聚体 滑动钳滑动钳 DNApol和和 DNApol 的主要特性和功能（的主要特性和功能（P47） 1、 DNA聚合酶活性：两者都有聚合酶活性：两者都有 条件条件模板、引物模板、引物 DNApol主要用于主要用于DNA 的修复和的修复和RNA引物的替换引物的替换 能填充很大的缺口，甚至整个互补链能填充很大的缺口，甚至整个互补链 DNApol DNA链的延长链的延长 填充几个碱

6、基的小缺口填充几个碱基的小缺口 2、 35 外切核酸酶活性外切核酸酶活性 校对功能校对功能(proofreading) 3、 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性 DNApol的的53外切活性有以下三个特点：外切活性有以下三个特点： 必须有必须有5磷酸末端磷酸末端 被除去的核苷酸必须是已经配对的被除去的核苷酸必须是已经配对的 被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖糖 核苷酸核苷酸 （缺口平移）（缺口平移）DNA复制保持准确性的机制复制保持准确性的机制:1、碱基互补配对、碱基互补配对2、复制酶的校对机制、复制酶的校对机制3、复制的起始具有引物：避免由于最初

7、几个核、复制的起始具有引物：避免由于最初几个核苷酸的复制错误导致的致死突变苷酸的复制错误导致的致死突变!4、从、从5到到3延伸延伸5、生物体的、生物体的DNA修复机制修复机制 拓扑异构酶拓扑异构酶：使：使DNA一条链发生断裂和再一条链发生断裂和再连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能连接。作用是松解负超螺旋，反应不需要能量。主要集中在活性转录区，同转录有关。量。主要集中在活性转录区，同转录有关。拓扑异构酶拓扑异构酶：使：使DNA两条链发生断裂和再连两条链发生断裂和再连接。当引入负超螺旋时需要由接。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量，提供能量，同复制有关。同复制有关。OriC in E. co

8、li chromosomal DNA oriC与与 E.coli 复制的起始（复制的起始（P44） 四个四个9bp的重复序列的重复序列 dnaA结合位点结合位点 三个三个13bp的重复序列的重复序列若干若干GATC位点位点打开打开DNA超螺链超螺链打开双螺旋打开双螺旋防止复螺旋防止复螺旋单链结合蛋白单链结合蛋白解链酶解链酶引物复合体引物复合体引物酶引物酶拓扑异构酶拓扑异构酶合成合成1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。2、Dna A蛋白识别并在蛋白识别并在ATP存在存在下结合于四个下结合于四个9bp的重复序列。的重复序列。3、在类组蛋白（、在类组蛋白（HU、ATP参与参与下下, D

9、an A蛋白变性蛋白变性13个个bp的重的重复序列复序列,形成开链复合物。形成开链复合物。4 、Dna B借助于水解借助于水解ATP产生产生的能量在的能量在Dna C的帮助下沿的帮助下沿5 3 方向移动，解开方向移动，解开DNA双链，形成双链，形成前引发复合物。前引发复合物。5、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna G蛋白）蛋白）开始合成开始合成RNA引物。引物。起始复合物起始复合物前引前引发复发复合物合物开链复合物开链复合物复制叉的复制叉的移动方向移动方向解旋酶解旋酶DNA聚合聚合酶酶III解链酶解链酶RNA引物引物引发体引发体DNA聚聚合酶

10、合酶ISSB3 3 5 前导链前导链滞后链滞后链3 5 复制的复制的起始起始DNADNA链的链的延长延长DNADNA链链终止终止5 RNA引物引物3 3 过程过程复制体复制体专一性终止蛋白专一性终止蛋白 E.coli 中由中由 tus gene 编码编码 （terminus utilization substance） 通过抑制通过抑制DNA解链酶解链酶而发挥终止作用而发挥终止作用 每次复制时只使用一个终止位点每次复制时只使用一个终止位点ter 第四节第四节 真核生物的真核生物的DNA聚合酶（聚合酶（P48） 、五种五种 位置位置 核内核内 核内核内 核内核内 核内核内 线粒体线粒体 合成合成

11、 与与引发引发 修复修复 合成合成 合成合成,修复修复 复制复制功能功能 酶酶结合结合 前导链前导链 后随链后随链35校校 NO NO Yes Yes Yes正活性正活性 第五节第五节 DNA损伤、修复和突变损伤、修复和突变概述：损伤因素及其类型概述：损伤因素及其类型复制过程中的错配修复复制过程中的错配修复损伤修复损伤修复 广义的修复系统：广义的修复系统： DNA聚合酶的校对功能聚合酶的校对功能 (复制的范畴复制的范畴) 错配修复错配修复 碱基切除修复碱基切除修复（尿嘧啶（尿嘧啶-N-糖苷酶修复系统）糖苷酶修复系统） 核苷酸切除修复核苷酸切除修复 直接修复直接修复 (光复活、重组修复、光复活、

12、重组修复、SOS修复等修复等) 错配修复错配修复(P50)(P50)DNA中的中的GATC为为m6A甲基化敏感位点甲基化敏感位点平均每平均每2kb左右有一左右有一GATC 甲基化程度的差异甲基化程度的差异MutL/MutS 扫描识别错配扫描识别错配 碱基和邻近的碱基和邻近的GATC序列序列 切点甲基化切点甲基化GATC中中 G的的5侧侧 DNA helicase, SSB, exonuclease I去除包括错去除包括错 配碱基的片段配碱基的片段 DNA polymerase III 和和 DNA ligase 填充缺口填充缺口昂贵的代价用于保证昂贵的代价用于保证DNA的准确性的准确性修复过程

13、修复过程 碱基切除修复碱基切除修复 (P51)尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶糖苷酶 系统系统 ( ung system )修复尿嘧啶的来源：修复尿嘧啶的来源：dUTP的渗入的渗入 胞嘧啶的自发脱氨氧化胞嘧啶的自发脱氨氧化-TAGC-ATCG-TAGC-A CG-U-TAGC-尿嘧啶尿嘧啶-N-糖苷酶糖苷酶 GCUAU-TAGC-A CG-AP内切酶内切酶(Apurinase)-TAGC-ATCG-DNApol Ligase 核苷酸切除修复核苷酸切除修复(P54) PR1、光复活（、光复活（photo reactivation ）-TT-AA-TT-AA-TT-AA-TT-AA- 复制前修复、不容易出

14、错复制前修复、不容易出错 400 nm 蓝光、蓝光、PR 酶酶 (photo-reactivation enzyme) 光敏裂合酶（光敏裂合酶（photolyase）可见光激活可见光激活二聚体修复的机制：二聚体修复的机制：2. 切除修复切除修复ExisionRepair 复制前进行复制前进行 不易出错不易出错UvrA, B, C gene 内切核酸酶内切核酸酶（Endonucleases） 外切核酸酶外切核酸酶 （Exonuclease） DNA pol DNA Ligase核苷酸切除修复核苷酸切除修复 3、重组修复、重组修复（RecombinativeRepair） 复制后修复复制后修复 ，容易出错，容易出错 RecA（催化（催化DNA 分子间分子间的同源联会和交换单链）的同源联会和交换单链） DNA pol DNA ligase二聚体后起始二聚体后起始 RecA 聚合酶、连接酶聚合酶、连接酶4、 SOS 修复机制修复机制 SOS 修复无模板指导的修复无模板指导的DNA复制