实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目蛋白质PPT学习教案

1、会计学1实验七亲和层析纯化和实验七亲和层析纯化和SDSPAGE鉴定目鉴定目蛋白质蛋白质第1页/共38页第2页/共38页n外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、细多糖、糖蛋白、细胞表面受体胞表面受体n核酸核酸-互补序列（互补序列（Oligo-dT）第3页/共38页亲和层析原理亲和层析原理第4页/共38页第5页/共38页第6页/共38页第7页/共38页第8页/共38页第9页/共38页第10页/共38页第11页/共38页n每组取每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。上清液，上柱纯化。第12页/共38页 GSH-Sepharose 4B第13页/共38页第14页/共38页样缓冲液，混匀后在沸水中样缓冲液，

2、混匀后在沸水中加热加热3 min。第15页/共38页 1 2 3 M 1 2 3 M 样品加样品加30 uL30 uLMarkerMarker加加10 uL10 uL第16页/共38页加水定容到加水定容到5000 mL。第17页/共38页0.15366 g，50 mL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）中。中。第18页/共38页第19页/共38页第20页/共38页 logMW=K-bm实验原理实验原理第21页/共38页第22页/共38页缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、pH、凝胶、凝胶浓度及电位梯度的不连续性。浓度及电位梯度的不连续性。第23页/共38页1. 凝胶孔径的不连续性凝胶孔径

3、的不连续性（2种孔径）种孔径）2. 缓冲液离子成分及缓冲液离子成分及pH值的不连续性值的不连续性（2种种缓冲体系，缓冲体系，3种种pH）：浓缩胶，）：浓缩胶，pH6.8，蛋白，蛋白质分子的迁移率比质分子的迁移率比Cl- 低，比低，比Gly高。高。浓缩效应浓缩效应第24页/共38页3. 电位梯度不连续性：电位梯度不连续性：快离子（快离子（ Cl- ）后面）后面形成高电位梯度区，慢离子（形成高电位梯度区，慢离子（Gly）前面形成）前面形成低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之低电位梯度区，高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动间的地方，形成一个稳定而不断向阳极移动的界面，蛋

4、白质分子在界面处浓缩成一个狭的界面，蛋白质分子在界面处浓缩成一个狭小的中间层。小的中间层。浓缩效应浓缩效应第25页/共38页第26页/共38页试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O2.5 mL30% Acr-Bis（29:1）3.0 mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）2.0 mL10% SDS75 uLTEMED（加速剂）（加速剂）10 uL10% AP（催化剂，最后加）（催化剂，最后加）75 uL总体积总体积7.5 mL第27页/共38页试剂名称试剂名称加液量加液量ddH2O3.4 mL30% Acr-Bis（29:1）0.86mL1.5 mol/L Tris-HCl（pH6.8）0.62mL10%SDS50 uLTEMED20 uL10%AP（最后加）（最后加）50 uL总体积总体积5.0 mL第28页/共38页第29页/共38页10. 观察胶中的蛋白质条带。观察胶中的蛋白质条带。第30页/共38页 纯化前纯化前 纯化后纯化后 MarkerMarker第31页/共38页第32页/共38页第33页/共38页水，用水，用1.0 mol/L HCl调节调节pH到到8.8，用蒸馏水稀释到，用蒸馏水稀释到100 mL。第34页/共38页5. 10 %（W/V）过硫酸铵）过硫酸铵（现用现（现用现配）配）第35页/共38页uL上样缓冲液。上样缓冲液。第