药学分生DNA复制和修复PPT课件

1、Reverse transcription中心法则图示第1页/共78页第一节 DNA的复制第2页/共78页DNA复制是一个由多种酶催化和有多种蛋白质参与的受到精密调控的过程； DNA是细胞中唯一具修复系统的生物大分子。第3页/共78页复制：复制：以亲代（母链）以亲代（母链）DNA为模板合成子代为模板合成子代DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA一、一、DNADNA复制的一般特征复制的一般特征第4页/共78页（一）半保留复制 DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开解开为为两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，两股单链，各自作为模板按碱基配对规律，合成与模板互补的子链

2、。子代细胞的合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从一股单链从亲代完整地接受亲代完整地接受过来，另一股过来，另一股单链则完全单链则完全从新合成从新合成。两个子细胞的。两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方碱基序列一致。这种复制方式称为式称为半保留复制半保留复制。半保留复制第5页/共78页DNA复制可能的三种方式第6页/共78页 半保留复制的证明：半保留复制的证明： Meselson Meselson 和和StahlStahl将同位素将同位素1515N N标记的标记的1515NHNH4 4ClCl加入大肠杆菌的培养基中培养加入大肠杆菌的培养基中培养1212代，

3、代，使大肠杆菌的使大肠杆菌的DNADNA都带上都带上1515N N的标记，然后的标记，然后将该大肠杆菌转入将该大肠杆菌转入1414N N的普通培养基中培养的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四后，分离子一代、子二代、子三代、子四代代DNADNA，进行，进行氯化铯氯化铯密度梯度离心，实验密度梯度离心，实验证明了证明了DNADNA的半保留复制。的半保留复制。第7页/共78页由Meselson和Stahl设计证明半保留复制的实验的被誉为生物学最美丽的实验第8页/共78页Meselson 和Stahl的证明DNA半保留复制的实验流程 第9页/共78页1515N-DNAN-DNA的密度大

4、于的密度大于1414N-DNAN-DNA的密度的密度第10页/共78页第11页/共78页按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。半保留复制的意义第12页/共78页DNADNA复制的起点和方式复制的起点和方式 复制起点：DNA复制总是从某一特定区域开始，这个特定区域是基因组内的一段特殊碱基序列，称为复制起点，ori或O不同生物有不同

5、的复制起点，但都富含AT配对特征富含A T配对的区域经常处于开发与闭合的动态平衡之中，称为DNA的呼吸作用。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。 第13页/共78页DNA复制起始区的特征第14页/共78页复制子复制子（replicon）一个复制子只含有一个复制起点。两个相邻起始点之间的两个相邻起始点之间的DNADNA片段，称为一个复制子。片段，称为一个复制子。复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。 第15页/共78页AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCAT

6、GACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 复制叉复制叉第16页/共78页电镜下真核生物DNA的多个复制叉结构第17页/共78页复制叉的结构当DNADNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNADNA双链因发生解链而形成叉状结构，这样的结构被称为复制叉 第18页/共78页大多数原核和真核生物复制时，大多数原核和真核生物复制时，DNA都是都是从从固定起始点固定起始点开始向两个方向解链，形成两个开始向两个方向解链，形成两个延伸

7、方向相反的复制叉，称为延伸方向相反的复制叉，称为双向复制双向复制。复制方向 （1） 双向复制（bidirectional replication）（2）单向复制 从特定的位置开始，单方向进行复制。（3）不对称的双向复制 第19页/共78页双向复制双向复制单向复制单向复制第20页/共78页（三）、半不连续复制 1、 体内仅存在5 3的DNA聚合酶2、 先导链与后随链（岗崎片段）第21页/共78页先导链先导链后随链后随链冈崎片段冈崎片段先导链：先导链：后随链：后随链：复制方向与解链方向一致复制方向与解链方向相反冈崎片段冈崎片段第22页/共78页第23页/共78页RNARNA引物引物DNADNA聚合

8、酶聚合酶 不能不能催化两个游离催化两个游离dNTPdNTP在在DNADNA模板上聚模板上聚合合 需要具需要具3 3-OH-OH的引物的引物RNARNA聚合酶聚合酶 能催化两个游离能催化两个游离NTPNTP在在DNADNA模板上聚合模板上聚合 提供提供3 3-OH-OH 引物最后被引物最后被DNADNA聚合聚合酶酶除去、补满，再除去、补满，再由连接酶连接由连接酶连接第24页/共78页发现（发现（19681968）：）： 同位素实验，同位素实验，3 3HdTHdT 短时间内为短时间内为DNADNA小片段小片段一段时间后一段时间后检测检测到到 DNADNA大片段。当用大片段。当用DNADNA连接酶的

9、变异株时，检测到大量连接酶的变异株时，检测到大量DNADNA片段的片段的积累。积累。证明证明DNADNA复制中有小片段合成。复制中有小片段合成。测定测定DNADNA小片段，远远大于合成小片段，远远大于合成DNADNA的一半。的一半。由于由于U U替代替代dTdT，被尿嘧被尿嘧啶啶- -N-N-糖基酶切除。糖基酶切除。在缺少尿嘧啶在缺少尿嘧啶- -N-N-糖基酶的突变植株中，糖基酶的突变植株中，检测到一半检测到一半3 3H H标记出现在标记出现在小片段（小片段（冈崎片段冈崎片段）中。）中。第25页/共78页二 DNA DNA复制的酶学1、使DNA链解离的酶l 解旋酶l 单链DNA结合蛋白l DN

10、A旋转酶（拓扑异构酶）第26页/共78页（1）解螺旋酶）解螺旋酶(helicase)（DnaB 蛋白）：蛋白）：利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链（2）单链）单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整链的完整 E.Coli中的中的SSB 以四聚体形式存在，与以四聚体形式存在，与DNA结结合具有协同作用。合具有协同作用。DNADNA复制的酶学复制的酶学第27页/共78页1010 8 8

11、 局部解链后局部解链后（3）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 拓扑异构酶：该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，作用是将负超螺旋引入DNA分子。同复制有关。第28页/共78页解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成第29页/共78页 此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物（Primer)。实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。1、RNA引物酶：2 2、DNADNA复制过程中的酶复制过程中的酶第30页/共78页n(2) DNA聚合酶：n原料：原料：四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸 （dATPdATP、dGTP dCTP dTTP)dGT

12、P dCTP dTTP)n需要模板：需要模板：以以DNADNA为模板链，合成子代为模板链，合成子代DNADNA，模板可以，模板可以是双链，也可以是单链是双链，也可以是单链DNADNA。合成产物与模板互补。合成产物与模板互补。n 需要引物：需要引物：一小段一小段RNA(RNA(或或DNADNA）为引物，在大肠杆）为引物，在大肠杆 菌中，菌中，DNADNA的合成需要一段的合成需要一段RNARNA链作为引物，引物含链作为引物，引物含3 3 -OH. -OH. n合成方向：合成方向：5 5 3 3 第31页/共78页第32页/共78页 DNAP I: 占聚合酶总活性的90% 在DNA修复中起作用(19

13、99年得到证明) 主要的DNA复制酶 在DNA修复中起作用（在1999年发现）在DNA修复中起作用（在1999年发现） DNA聚合酶家族第33页/共78页 在真核生物中，目前发现的DNADNA聚合酶有五种，分别命名为DNADNA聚合酶（pol pol ），DNADNA聚合酶（polpol），DNADNA聚合酶（polpol），DNADNA聚合酶（pol pol ），DNADNA聚合酶（polpol）。 其中，参与染色体DNADNA复制的是polpol（延长滞后链）和polpol（延长前导链），参与线粒体DNADNA复制的是polpol，polpol与DNADNA损伤修复、校读和填补缺口有关，p

14、olpol只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。 第34页/共78页参与参与DNA复制的酶复制的酶与蛋白因与蛋白因子子第35页/共78页（一）复制的起始（二）复制的延长（三）复制的终止三、DNA复制过程：第36页/共78页复制原点复制原点oriC和原点的识别：和原点的识别： DNA DNA的复制有特定的起始位点，叫做的复制有特定的起始位点，叫做复制原点复制原点。常用。常用ori C(ori C(或或o o）表示。大肠杆菌的复制原点）表示。大肠杆菌的复制原点ori Cori C由由245245个个bpbp构成，含两组保守的重复序列：三个构成，含两组保守的重复序列：三个13bp13bp的序列（富含的序

15、列（富含A A、T T的序列）和四个的序列）和四个9bp9bp的序列；许多生物的复制原点也都是的序列；许多生物的复制原点也都是富含富含A A、T T的区段的区段。第37页/共78页（一）复制起始（一）复制起始1 1、拓扑异构酶解开超螺旋。、拓扑异构酶解开超螺旋。2 2、Dna ADna A蛋白识别并在蛋白识别并在ATPATP存在存在下结合于四个下结合于四个9bp9bp的重复序列。的重复序列。3 3、在类组蛋白、在类组蛋白HUHU、ATPATP参与下，参与下， Dan ADan A蛋白变性蛋白变性1313个个bpbp的重复序的重复序列列, ,形成开链复合物。形成开链复合物。4 4 、Dna BD

16、na B借助于水解借助于水解ATPATP产生产生的能量在的能量在Dna CDna C的帮助下沿的帮助下沿5 5 33 方向移动，解开方向移动，解开DNADNA双链，双链，形成前引发复合物。形成前引发复合物。5 5、单链结合蛋白结合于单链。、单链结合蛋白结合于单链。6 6、引物合成酶（、引物合成酶（Dna GDna G蛋白）蛋白）开始合成开始合成RNARNA引物。引物。第38页/共78页第39页/共78页(二二) 链的延链的延长（冈崎片长（冈崎片段的合成）段的合成） 真核生物的真核生物的冈崎片段为：冈崎片段为：100-200bp100-200bp 原核生物的原核生物的冈崎片段为：冈崎片段为：10

17、00-2000bp1000-2000bp第40页/共78页 DNA DNA链的延伸链的延伸 在在DNADNA聚合酶聚合酶的催化下，的催化下，以四种以四种5 5 - -脱氧核苷三磷脱氧核苷三磷酸为底物，在酸为底物，在RNARNA引物的引物的3 3端以磷酸二酯键连接上脱端以磷酸二酯键连接上脱氧核糖核苷酸并释放出焦氧核糖核苷酸并释放出焦磷酸。磷酸。DNADNA链的延伸同时进链的延伸同时进行前导链和滞后链的合成。行前导链和滞后链的合成。两条链方向相反。两条链方向相反。 先导链先导链 后随链后随链 冈崎片段冈崎片段 半不连续复制半不连续复制冈崎模型冈崎模型第41页/共78页冈崎片段引物的切除、缺口的填补

18、和切口的连接冈崎片段引物的切除、缺口的填补和切口的连接:第42页/共78页(三三) 复制的终复制的终止止顺时针终止陷阱顺时针终止陷阱逆时针终止陷阱逆时针终止陷阱 Ter: Ter:终止陷阱，引起复制终止的特定区域，终止陷阱，引起复制终止的特定区域，20bp20bp的序列，终止的序列，终止利用物质利用物质TusTus可识别并结合，从而导致可识别并结合，从而导致DNADNA复制的终止。复制的终止。第43页/共78页真核生物复制特点真核生物复制特点真核生物真核生物DNADNA复制与原核生物复制与原核生物DNADNA复制的复制的不同点：不同点：真核真核DNADNA有多个复制原点；有多个复制原点；2 2

19、真核生物有多种聚合酶。真核生物有多种聚合酶。 3 3真核生物染色体为线性，末端具有端粒结构，由端粒酶合成真核生物染色体为线性，末端具有端粒结构，由端粒酶合成 4 4真核生物染色体复制涉及核小体结构真核生物染色体复制涉及核小体结构第44页/共78页从哺乳动物中分出种从哺乳动物中分出种DNA polDNA pol酶。分别为酶。分别为polpol、。 PolPol（4 4亚基）：有引物合成酶活性。具有合成亚基）：有引物合成酶活性。具有合成RNARNA后后45dNTP45dNTP的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为的活性。无外切酶活性。持续性中等，约为100100核苷酸，完成滞核苷酸，完成滞后链后链

20、DNADNA复制。复制。 PolPol（2 2亚基）：有持续合成亚基）：有持续合成DNADNA链的能力，有链的能力，有3 3 5 5 核酸外切核酸外切酶活性（具有校正功能），完成前导链酶活性（具有校正功能），完成前导链DNADNA复制。复制。 PolPol（11亚基）：相当于亚基）：相当于E.E.colicoli的的polpol，是一种修复酶，具，是一种修复酶，具有有3 3 5 5 核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。 PolPol（1 1亚基）：与损伤修复有关。亚基）：与损伤修复有关。 PolPol（2 2亚基）：是线粒体亚基）：是线粒体DNADNA合成酶（合成酶（3 3 55 外切酶）外切酶）

21、 第45页/共78页四、特殊类型的复制 （一） 线粒体复制 线粒体DNA 双链闭环结构：重链、轻链 取代环复制（D环复制）第46页/共78页D-环复制线粒体和叶绿体DNA通常以D-环的方式进行复制。少数病毒，如腺病毒，也进行D-环复制 。催化线粒体DNA复制的酶是DNA聚合酶，两条链的合成都需要先合成RNA引物，但都不形成冈崎片段，因此都是连续合成。 两条子链的合成在时间上的不同步。 第47页/共78页D D环复制环复制（displacement replicationreplication）线粒体线粒体DNADNA的双股链分为轻链的双股链分为轻链和重链。它的复制是一种单和重链。它的复制是一种

22、单向不对称的特殊复制方式向不对称的特殊复制方式, ,称称为为环复制。环复制。复制从重链（链）的原点复制从重链（链）的原点开始，新合成的链置换原开始，新合成的链置换原来链，游离的单链称为取代来链，游离的单链称为取代链（链（displacementdisplacement）或环。）或环。 当链合成进行到约当链合成进行到约2/32/3时，时，轻链（链）的原点暴露出轻链（链）的原点暴露出来，并引发其合成，延伸方来，并引发其合成，延伸方向与链的相反。向与链的相反。 第48页/共78页D D环复制 第49页/共78页（二）、噬菌体和病毒DNA的复制1. 单链环状DNA病毒的复制1、第一阶段：以亲本单链（）

23、为模板，合成 互补链（），形成闭合的双链环状复制形。2、第二阶段：滚环复制。一个负链可以合成许多 正链，正链用于噬菌体包装。3-OH5-P3-OH5-P第50页/共78页2. 线状DNA病毒的复制 1、双链线状DNA的复制 有两种起始类型：从DNA分子的中间起始 从DNA分子末端起始腺病毒DNA的复制：从DNA分子末端起始， 以单链置换形式进行。第51页/共78页图 p116页第52页/共78页（2）、单链线状DNA的复制：微小病毒的复制图 p118页第53页/共78页RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA3. 逆

24、转录病毒的复制： 从单链RNA到双链DNA的生成分三步第54页/共78页u 逆转录酶有三种活性：RNA指导的DNA聚合酶活性；RNase活性；DNA指导的DNA聚合酶活性。第55页/共78页u 逆转录过程： 逆转录病毒RNA与宿主tRNA分子互补形成局 部双链，以tRNA为引物，合成DNA负链5端。 由RNaseH水解去除杂化双链中的RNA 5端。 新合成DNA负链的3端跳到模板RNA的3端， 并通过两条链上共同的R序列形成杂交链。 DNA负链向5端延伸。 RNaseH去除杂化双链中的绝大部分RNA 。 第56页/共78页 RNaseH去除RNA和tRNA引物。 DNA正链的正链的3端跳到端跳

25、到DNA负链的负链的3端，端， 以两条链共有的以两条链共有的PBS序列杂交，形成局部双链。序列杂交，形成局部双链。 双向延伸完成DNA双链合成。 以剩余的一段RNA作引物合成DNA正链的3端。 第57页/共78页第58页/共78页第59页/共78页 （一）内源性损伤 1. DNA复制错误：错配等 2. 碱基存在互变异构体，形成错误碱基配对 3. 自发的化学变化：脱嘌呤、脱氨基 4. 氧化作用损伤碱基一一 DNA DNA损伤类型损伤类型第60页/共78页（一）内源性损伤1、DNA的复制错误： 复制错误引起损伤，在DNA损伤中最为多见。2、由于碱基本身存在互变异构体，可能形成错误 的碱基配对。l

26、复制错误最多见于尿嘧啶（U）的渗入， 另外偶有其它碱基的渗入。第61页/共78页3、自发的化学变化：（1）脱嘌呤或脱嘧啶作用：是指DNA分子上丢掉了嘌呤碱或嘧啶碱，形成无碱基位点，称为AP部位 (apyrimidine，apurine site , AP)。 在生理状态下，脱嘌呤是脱嘧啶的20倍。（2）脱氨基作用：即胞嘧啶、腺嘌呤及鸟嘌呤 的环外氨基自发丢失。 胞嘧啶尿嘧啶；腺嘌呤次黄嘌呤； 鸟嘌呤黄嘌呤。脱氨基所至的碱基转 变可影响DNA的复制，由此产生突变。第62页/共78页4、氧化作用损伤碱基：代谢产生活性氧基团，使DNA氧化损伤第63页/共78页（二）外源性损伤（二）外源性损伤 物理因

27、素物理因素 化学因素化学因素 紫外线损伤（共轭双键）紫外线损伤（共轭双键） 电离辐射损伤（电离辐射损伤（X X线线/ / 线）线） 亚硝酸盐亚硝酸盐 C UC U 5-5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶 5-BU A 5-BU A 氮芥类氮芥类 烷化剂烷化剂 羟胺羟胺 C- A C- A GG第64页/共78页 物理因素： 由紫外线、电离辐射、X X射线等引起的DNADNA损伤。其中，X X射线和电离辐射常常引起DNADNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TTTT，TCTC，CCCC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。 第65页/共78页 化学因素：碱

28、基类似物：5-BU,5-BU,齐多夫定碱基修饰剂：亚硝酸、烷化剂第66页/共78页二二 DNA DNA损伤在药物评价中的应用损伤在药物评价中的应用遗传毒性试验：检测DNA损伤以及损伤的固定多种方法组合实验第67页/共78页 诱变育种 常用诱变剂：射线、烷化剂、碱基类似物、移码突变剂等三三 DNA DNA损伤与抗生素菌种诱变损伤与抗生素菌种诱变第68页/共78页v 在长期的进化过程中，生物体演化出了一整套十分有效的DNA损伤修复系统，包括： 纠正偶然复制错误的系统复制修复 DNA聚合酶的35校读功能 DNA糖苷酶修复系统 错配修复系统等第三节 DNA修复 复制后修复：主要包括 重组修复系统、SOS修复系统。 修复环境因素致DNA损伤的系统损伤修复 主要包括：光修复系统、切除修复系统第69页/共78页1、尿嘧