20120919微生态制剂.温都水城

1、杨禄良 研究员2012-09-21 饲用乳酸菌稳定性和耐受性 新技术与应用三、发酵前包被技术介绍二、乳酸菌使用过程中存在的问题一、饲用益生菌制剂的现状四、前包被肠球菌的应用举例报告内容一饲用益生菌制剂的现状4益生菌是微生态制剂的主体微生态制剂：指在微生态学理论的指导下，利用能够调整微生态失调、保持微生态平衡、提高宿主健康水平或增进健康状态的益生菌及其代谢产物和生长促进物质制成的制剂。微生态制剂益生菌（probiotics）益生元（prebiotics）合生素（synbiotics）4益生菌又称益生素，是指饲用后通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，达到提高宿主（人和动物）健康水平和健康佳

2、态的活菌制剂及其代谢产物。 益生菌（素）（probiotics) 可以直接饲喂动物，通过调节动物肠道微生态平衡，达到预防疾病、促进动物生长和提高饲料利用率的活的微生物和（或）其培养物（ Parker 1974）。益生菌的定义 5根据制剂的用途及作用机制可分为益生菌生长促进剂和益生菌治疗剂依据微生物的种类可分为芽孢杆菌制剂、乳酸菌制剂、酵母菌制剂、光合菌制剂及放线菌制剂微生态制剂按菌种组成可分为单一制剂和复合制剂依据应用范围可将微生态制剂分为医用益生菌制剂 、兽用益生菌制剂及农用益生菌制剂益生菌的分类 6益生作用补充有益菌群改善消化道菌群平衡刺激机体免疫系统发育参与菌群生存竞争补充机体营养成分促

3、进动物生长优势种群学说菌种屏障学说微生物代谢学说免疫调节学说益生菌的作用机理 回肠远端/ 盲肠 /结肠近端 抑制病原菌：大肠杆菌，沙门氏菌,弯曲杆菌, 螺旋体 等抑制假单胞菌、葡萄球菌、变形假丝酵母 等.直接增强抑制微生物菌群中病原菌的能力竞争性抑制大肠杆菌选择性刺激主要小肠菌群: 乳酸生产菌 产酸、乳酸菌素，维生素、酶等产生乳酸和短链脂肪酸益生菌（细菌、孢子、酵母）促进胃肠粘膜再生和健康刺激机理营养增殖抑杀结肠远端益生菌的作用机理优良益生菌的筛选来源安全性繁殖速度对胆盐、胃肠液的耐受性抗生素耐受性对致病菌的抑菌活性 产生消化酶在宿主肠道内的定殖“普遍认为是安全的(GRAS)” 微生物9饲料添

4、加剂品种目录（2010）微生物地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、乳酸肠球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母、沼泽红假单胞菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、罗伊氏乳杆菌、动物双歧杆菌、黑曲霉、米曲霉、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、保加利亚乳杆菌养殖动物产丙酸丙酸杆菌、布氏乳杆菌青贮饲料、牛饲料副干酪乳杆菌青贮饲料凝结芽孢杆菌肉鸡，生长育肥猪侧孢芽孢杆菌肉鸡、肉鸭、猪、虾10中国2010（34种）美国2009（45种）欧盟2008（72种）1017

5、7341145共99种目前可研究：99种（1）菌种：欧盟72种，美国45种，中国34种芽孢杆菌；酵母；乳酸菌双歧杆菌（2）工艺：?国外多是专业化的公司，均有几十年积累的开发生产经验，菌种经过选育，液体纯种发酵和菌体浓缩处理工艺，有效活菌含量比较高，杂菌率低，品质稳定，价格比较贵。国内活菌制剂专业化的公司比较少，15-20年开发生产经验几乎没有，菌种资源匮乏，发酵工艺出于初级探索阶段，尤其缺少菌体浓缩和包被稳定处理，杂菌率高，品质不稳，质量参差不齐，价格较低。（3）配套应用技术：养殖条件复杂有效性指标行业情况目前，美国微生物饲料添加剂年使用量约在50,000 吨以上，年销售额己超过2 亿美元；日

6、本每年使用微生态添加剂己达5,000 吨以上，价值超过2,000万美元。每年全球微生物饲料添加剂总销售额已超过25 亿美元。国内从事微生物饲料添加剂开发应用的企业很多，获得农业部生产许的约有100 家。国内微生物饲料添加剂年销售额大约在20 亿元，销售额在1亿元以上的不足5 家，产品年销售额在3,000 万元以上不过几十家，大多数企业的年销售额在1,000 万元以下。增强免疫力减轻粪便氨臭促进动物生长提高饲料利用率降低成本，提高经济效益改善饲养环境，有利动物身体健康减少抗生素残留，提高养殖产品的安全性改善动物健康状况，降低发病率益生菌制剂的效果益生菌对动物应用效果统计表应用效果不稳定二乳酸菌使

7、用中存在的问题基础研究方面：动物肠道微生态理论的认知EM系列；XP；发酵床宿主特异性生态平衡的缓冲能力专利生产菌株的保护知识产权；发酵剂；营养缺陷型18产业发展方面生产菌株资源匮乏：特性降低；拷贝生产成本高产品功效不稳定配套应用技术不规范：养殖模式；配伍产品功能细分标准检测方法：标准（少）19益生菌制剂应用存在的主要问题应用效果不稳定胃酸、胆盐饲料中的微量元素(铜、锌等)饲料加工制粒过程中的高温、高压运输、贮存过程中的不良环境菌种的来源和遗传稳定性阻碍了益生菌制剂产业的发展采用保护措施，如改变生产工艺，温和生产条件筛选耐高温、抗酸抗胆盐菌株解决措施微胶囊包被技术被认为是解决这一问题的关键技术微

8、胶囊包被技术三发酵前包被技术介绍益生菌制剂未包被（第一代）后包被（第二代）：包埋率低、活菌含量低、成本高前包被（第三代）：稳定性强、包埋率高、活菌含量高，易于工业化发酵前包被技术为解决益生菌制剂的稳定性问题提供了一条适用的、低成本的工业化途径微胶囊是利用天然或合成的高分子材料对固体、液体或气体进行包封，粒径为5-1000m的中空胶囊，制备微胶囊的过程称为微胶囊化。2022/7/624芯材Core material壁材 Wall material微囊化细胞的组成常用壁材：天然材料、半合成材料高分子材料微胶囊的功能 改变产品的形态使其具有良好的流动性和分散性 采用肠溶性壁材，实现肠道定点释放 保护

9、活菌，提高产品的稳定性和有效性 25 微囊化效率高 产品稳定性强 设备成本低、通用性强、兼容性好 有效活菌含量高发酵前包被技术的优势：26制备微胶囊1h、8h、10h时镜检照片 1 h8 h10 h 有效活菌含量高在相同的培养条件下，消耗相同的发酵原料，发酵前包被最终产品中单位活菌数是后包被的10-100倍不等发酵前包被微生物可通过后期培养在微胶囊微环境下大量增殖微胶囊产品活菌含量高（可达1011 CFU/g）发酵后包被（喷雾干燥法和流化床包被）包被过程中菌体分散不均匀及死亡率高微胶囊产品活菌含量低（通常为1091010 CFU/g） 有效活菌含量高109CFU/mL1010CFU/mL微囊化

10、前包被粪肠球菌代谢曲线对比包被前后乳酸代谢曲线比较包被前后葡萄糖代谢曲线比较 微囊化前包被粪肠球菌生长曲线对比 微囊化效率高 产品稳定性强 设备成本低、通用性强、兼容性好 有效活菌含量高发酵前包被技术的优势：31微胶囊表面活菌数(CFU/ml）产品中活菌数(CFU/ml）微囊化效率平均值8.731058.6310899.90%99.82%3.831061.2510999.69%1.291069.6310899.87%发酵前包被工艺的微囊化效率注：微囊化效率= 【1 （微胶囊表面活菌数/产品中活菌数）】100% 微囊化效率高 微囊化效率高 产品稳定性强 设备成本低、通用性强、兼容性好 有效活菌含

11、量高发酵前包被技术的优势：3380高温处理10min，微胶囊包被产品的活菌数是未包被产品的100倍左右。微囊化肠球菌对高温的耐受性强2.01-lgCFU/g0.27-lgCFU/g微囊化肠球菌对80高温的耐受性微囊化肠球菌对胆盐的耐受性强微囊化肠球菌对胆盐（ 0.4% ）的耐受性微囊化肠球菌体外模拟胃（左）肠（右）液试验微囊化肠球菌对模拟胃液的耐受性强1.53-lgCFU/g在模拟胃液中处理4h，微胶囊包被产品的活菌数是未包被产品的50倍左右。微囊化肠球菌对高铜、高锌的耐受性在高铜和高锌的条件下培养10h，包被培养的活菌数比游离培养高两个多数量级blank0.1%CuSO40.3%ZnO0.1

12、%CuSO4 and 0.3%ZnOFree cellsMicroencapsulated cells 微囊化效率高 产品稳定性强 设备成本低、通用性强、兼容性好 有效活菌含量高发酵前包被技术的优势：解决了乳酸菌类饲料添加剂长期以来有效活菌含量低、抗逆性能差、成本高的“技术瓶颈”实现生物微胶囊制备和发酵一体化38干燥前（粒径1-2mm） 干燥后（粒径0.3-0.5mm）（新型前包被粪肠球菌）39蒸汽系统培养系统空气系统水软化加热变蒸汽分汽包分流原料等消毒空气粗滤压滤降温除水储气罐精过滤斜面培养摇瓶扩大培养一级种子二级种子发酵前包被发酵离心产品低温干燥微囊化菌体工艺流程高度严格和专业化的生产过程

13、产品稳定性实验：对照组：添加不包被粪肠球菌制剂100g/t试验组：添加微囊化前包被粪肠球菌制剂100g/t四种制粒条件-A：压力0.1Mpa，温度65； B：压力0.2Mpa，温度70； C：压力0.3Mpa，温度80； D：压力0.4Mpa，温度85。组别粉料中的活菌数(106cfu/g) 制粒后活菌数(106cfu/g)存活率(%)颗粒料储存1个月(%)颗粒料储存3个月(%)颗粒料储存6个月(%)对照组A-11.220.3931.97 22.13 9.84 -B-11.110.2219.82 8.11 -C-11.020.8482.35 0.98 -D-11.210.0060.50 -试验

14、组A-21.261.1994.44 93.65 92.06 88.10 B-21.171.1295.73 92.31 90.60 87.18 C-20.980.8889.80 88.78 86.73 85.71 D-21.120.9886.50 86.39 84.61 80.87 四前包被肠球菌的应用举例肉鸡饲喂-试验设计（1）饲养数量：AA公肉鸡180只饲养时间：共计42d 分组设计：将180只肉仔鸡随机分成3组，每组6个重复，每重复10只。空白对照组： （饲喂不加抗生素的基础日粮）发酵液添加组： （饲喂不加抗生素的基础日粮+1109CFU肠球菌发酵液/kg饲料）微囊化前包被添加组：（饲喂不

15、加抗生素的基础日粮+1109CFU肠球菌微胶囊/kg饲料）ASAGF1.0007表1 对肉仔鸡生长性能的影响Table 1 Effects of microcapsulated ASAGF10-1 on growth performance of broilers结论：饲养全期（1-42 d），与空白对照组和发酵液添加组相比，微胶囊添加组肉仔鸡平均日增重分别提高了16.94%（P0.05）和11.25%（P0.05）；料重比分别降低了16.13%(P0.05）。表2 对42日龄肉仔鸡胸腺、脾脏、法氏囊相对重量的影响 Table2 Effects of microcapsulated ASAGF

16、10-1 on the relative weight of thymus, spleen and bursa of 42-day-old broilers结论：42日龄时微胶囊添加组与空白对照组和发酵液组相比较，肉仔鸡的胸腺相对重量分别提高了46.56%（P0.05）和18.38%（P0.05），法氏囊相对重量分别提高了16.67%（P0.05）。表3 42日龄AA肉鸡粪便中菌群数量结果Table3 quantitative data of bacterium in fecal samples结论：比较空白对照组和发酵液添加组，微囊添加组肉鸡粪便中双歧杆菌和乳杆菌的数量显著提高（P0.05）

17、。42日龄肉鸡盲肠内容物DGGE电泳图对照组未包被肠球菌包被肠球菌乳酸菌条带大肠杆菌条带肉鸡饲喂-试验设计（2）饲养数量：AA公肉鸡180只饲养时间：共计42d 分组设计：将180只肉仔鸡随机分成6组，每组6个重复，每重复5只。对照组：（饲喂不加抗生素的基础日粮+空微胶囊壁材按A组百分比添加）A组(高剂量)： （饲喂不加抗生素的基础日粮+11010CFU肠球菌微胶囊/kg饲料）B组(中剂量)： （饲喂不加抗生素的基础日粮+1 109CFU肠球菌微胶囊/kg饲料）C组(低剂量)： （饲喂不加抗生素的基础日粮+2108CFU肠球菌微胶囊 /kg饲料）D组(抗生素)： （饲喂加抗生素的基础日粮）E组

18、(国外产品)：（饲喂不加抗生素的基础日粮+某进口多层包被粪肠球菌 1-21d，0.75g/kg；22-42d，0.5g/kg饲料）对肉仔鸡生长性能的影响结论（饲养全期142d）日增重与空白对照组比较，高剂量组和中剂量组日增重分别提高9.90%(P0.05)和9.50%(P0.05),且两组日增重均显著高于国外产品对照组(P0.05)。料重比与空白对照组比较，高剂量组和中剂量组料重比分别降低10.04%(P0.05)和9.62%(P0.05)。与抗生素组比较，高剂量组和中剂量组料肉比无显著性差异。与国外产品对照组比较，高剂量组和中剂量组料肉比分别降低4.4%(P0.05)和4%(P0.05)。十

19、二指肠Duodenum 空肠Jejunum 回肠Ileum 十二指肠Duodenum 空肠Jejunum 回肠Ileum 21d42d对肉仔鸡小肠绒毛形态结构的影响左图：空白对照； 右图：中剂量组结论：对照组绒毛大多较短较粗，排列不规则，有缺损且脱落严重，单位面积上肠绒毛数量少。微囊化肠球菌组肠绒毛明显变长，比例协调，排列整齐，高低均匀，单位面积上肠绒毛数量多。血液抗氧化指标丙二醛含量总抗氧化能力（T-AOC）总超氧化物歧化酶（T-SOD）结论：相对对照组、抗生素组及国外产品对照组，微囊化肠球菌添加组（高剂量、中剂量、低剂量）表现出更强的抗氧化能力。肉鸡攻毒-试验设计饲养数量：AA公肉鸡90只

20、饲养时间：共计42d 分组设计：将90只肉仔鸡随机分成3组，每组6个重复，每重复5只。对照组： （基础日粮）发酵液添加组： （基础日粮+30g速大肥/t饲料）微囊化前包被添加组：（基础日粮+1109CFU肠球菌微胶囊/kg饲料）粪肠球菌对肉仔鸡21 d生长性能的影响粪肠球菌对肉仔鸡攻毒后7 d生长性能的影响组别死亡率（%）对照1组对照2组40.008.94b26.676.67b试验组 3.333.33aP值0.005 粪肠球菌对肉仔鸡攻毒7 d后死亡率的影响断奶仔猪饲喂-试验设计饲养数量：断奶仔猪204头饲养时间：共计35d 试验地点：山东农业大学试验猪场分组设计：处 理试验猪（头）试验日粮空

21、白对照组317基础日粮低剂量组317基础日粮+5108CFU肠球菌微胶囊/kg饲料中剂量组317基础日粮+1109CFU肠球菌微胶囊/kg饲料高剂量组317基础日粮+5109CFU肠球菌微胶囊/kg饲料处 理腹泻率，腹泻指数，死淘率，空白对照组4.07a2.109a5.88低剂量组2.63b0.938b0中剂量组2.48b0.863b1.96高剂量组2.27b0.725b0SEM0.0010.0320.003 P0.0600.0060.152 表1 对仔猪腹泻率的影响结论：与对照组相比，添加微囊化肠球菌组均可显著降低仔猪的腹泻率（P 0.05），降低腹泻率分别为35.38、39.1、44.3。

22、处 理十二指肠空肠回肠空白组1.741.73c1.53低剂量组1.771.81bc1.82中剂量组1.882.13a1.82高剂量组1.842.07ab1.86SEM0.0250.0150.022P0.9520.0310.388表2 对断奶仔猪各肠段绒腺比的影响结论：与对照组相比，中剂量组和高剂量组均显著提高了仔猪空肠绒腺比（P 0.05）（分别提高22.6和19.4）。处 理非厌氧菌大肠杆菌乳酸菌空白组4.79b6.43a5.91低剂量组6.31a6.46a6.15中剂量组5.84ab5.67ab6.01高剂量组5.70ab4.65bc6.75SEM0.080.070.11p0.8690.1

23、960.023表3 对仔猪空肠微生物的影响， lg CFU / g结论：低剂量组可以显著增加仔猪空肠非厌氧菌数量（P 0.05）。与对照组相比，高剂量组和抗生素组均显著降低了仔猪空肠中大肠杆菌数量（P 0.05）。与对照组相比，低剂量组、中剂量组和高剂量组有逐步增加回肠中乳酸菌数量的趋势（4.1、1.6和14.2）处 理非厌氧菌大肠杆菌乳酸菌空白组6.397.21a6.01b低剂量组6.816.23ab6.81ab中剂量组6.636.51ab7.29a高剂量组6.674.89b7.37aSEM0.060.110.05p0.8690.1960.023表4 对仔猪回肠微生物的影响， lg CFU / g结论：低剂量组、中剂量组和高剂量组均有增加非厌氧菌总数的趋势（6.70、3.79和4.52）。与对照组相比，高剂量组可显著降低仔猪回肠中大肠杆菌数量32.2（P 0.05），低剂量组和中剂量组在数值上有降低仔猪回肠大肠杆菌数量的趋势。抗生素组、中剂量组和高剂量组均显著增加了仔猪回肠乳酸菌