第一章光谱技术

1、第一章第一章 光光 谱谱 技技 术术 作作 者者: 王王 英英 联系电话联系电话:许多物质有颜色许多物质有颜色,大量大量无色的物质无色的物质可以与可以与显色显色剂剂作用生成作用生成有色的物质有色的物质，这些有色的物质，这些有色的物质颜色的颜色的深浅与其浓度成正相关深浅与其浓度成正相关，则浓度越大，颜色越深。，则浓度越大，颜色越深。故故通过测定物质颜色的深浅来对物质进行定量分通过测定物质颜色的深浅来对物质进行定量分析的方法析的方法，称为，称为比色分析法。比色分析法。 一、比色分析发展的概况：一、比色分析发展的概况： 最早的最早的纳氏比色法纳氏比色法是按是按浓度浓度从从低

2、低到到高高，配好，配好系列标准管，然后将待测样品与标准管进行比较系列标准管，然后将待测样品与标准管进行比较定量，如定量，如黄疸指数黄疸指数的测定，它属于的测定，它属于目力比色法目力比色法。这种这种方法很简单方法很简单，但人为，但人为误差很大误差很大。 概概 述述 后来造出后来造出光电比色计光电比色计，其原理是，其原理是一束平行单色一束平行单色光光通过一定厚度的通过一定厚度的有色溶液有色溶液时，一部分光被吸收，时，一部分光被吸收，未被吸收的光透过溶液照到光电池上，光电池将光未被吸收的光透过溶液照到光电池上，光电池将光能转换成电能，推动检流计偏转，再和标准管比较能转换成电能，推动检流计偏转，再和标

3、准管比较可计算出待测溶液的浓度。可计算出待测溶液的浓度。 我国早年生产的光电比色计有我国早年生产的光电比色计有 58-1G等。等。 光电比色计用光电比色计用滤光片滤光片来分光，只适合在有限波来分光，只适合在有限波长内测量，不能满足不同分析工作的需要。长内测量，不能满足不同分析工作的需要。 为了克服以上不足制造了性能更好的为了克服以上不足制造了性能更好的分光光度分光光度计计，分光光度，分光光度计计将分析区域扩展到将分析区域扩展到红外和紫外红外和紫外波段。波段。这样许多用普通比色法无法进行分析的无色物质，这样许多用普通比色法无法进行分析的无色物质，只要在红外或紫外区域内只要在红外或紫外区域内有适当

4、的吸收峰有适当的吸收峰，便可以，便可以用相应的分光光度用相应的分光光度计计加以测定。从而大大扩展了物加以测定。从而大大扩展了物质的测定范围，尤其是在有机化合物检测方面的应质的测定范围，尤其是在有机化合物检测方面的应用。用。 分光光度分光光度计分计分吸收光谱仪吸收光谱仪和和发射光谱仪发射光谱仪两类。两类。 发射光谱仪主要有光栅光谱仪、荧光分光光度发射光谱仪主要有光栅光谱仪、荧光分光光度计和火焰光度计。计和火焰光度计。可见及紫外分光光度计、红外分可见及紫外分光光度计、红外分光光度计等为吸收光谱仪。光光度计等为吸收光谱仪。 根据物质具有根据物质具有吸收吸收、发射发射或或散射光谱散射光谱谱系的谱系的特

5、征，来测定其特征，来测定其性质、结构性质、结构或或含量含量的一类分析技的一类分析技术称为术称为光谱光谱分析分析技术技术。 光谱分析技术包括光谱分析技术包括吸收光谱分析吸收光谱分析、发射光谱发射光谱分析分析和和散射光谱分析散射光谱分析三大类。三大类。 它具有灵敏、快速、准确、简便等优点，是它具有灵敏、快速、准确、简便等优点，是一种最常用的生化分析技术。一种最常用的生化分析技术。 常用的有：可见及紫外分光光度法、常用的有：可见及紫外分光光度法、红外分红外分光光度法、光光度法、荧光法，原子吸收光谱法、火焰光度荧光法，原子吸收光谱法、火焰光度法及比浊法等。法及比浊法等。二二、光谱分析技术光谱分析技术第

6、一节第一节 光谱分析的基本原理光谱分析的基本原理一、光的基本性质一、光的基本性质 光是一种光是一种电磁波电磁波，是，是能能的一种的一种表现形式表现形式，是一种以是一种以巨大速度巨大速度通过空间传播的通过空间传播的光量子流光量子流，在不同的介质可发生在不同的介质可发生反射、折射、衍射、色散反射、折射、衍射、色散和偏振和偏振等现象。等现象。 光是电，电是光，光是电，电是光，光电可相互转换光电可相互转换。 光具有波动性光具有波动性，以波动的形式进行传播，并可，以波动的形式进行传播，并可用用波长波长、频率频率、传播、传播速度速度等参数来描述。等参数来描述。 两个波峰之间的距离为波长（两个波峰之间的距离

7、为波长（ ），单位时间内），单位时间内通过某一点波的数目为频率（通过某一点波的数目为频率（ ）, c为光速。为光速。 波长与频率之间的关系是：波长与频率之间的关系是： 不同波长的光具有不同的能量，光的不同波长的光具有不同的能量，光的能量能量与光的与光的波长波长成成反比反比，波长越长（频率越低），能量越小；波，波长越长（频率越低），能量越小；波长越短（频率越高），则能量越大。紫外光的波长小长越短（频率越高），则能量越大。紫外光的波长小于可见光和红外光的波长，因此，紫外光的能量大于于可见光和红外光的波长，因此，紫外光的能量大于可见光和红外光的能量。可见光和红外光的能量。c二、光谱二、光谱 光谱是复

8、合光（白光）经色散后的光谱是复合光（白光）经色散后的单色光单色光按一定按一定顺序顺序排成一幅排成一幅光的色谱光的色谱。 光谱又可分为光谱又可分为发射光谱发射光谱、吸收光谱吸收光谱和和散射光谱散射光谱。 1. 发射光谱发射光谱 发光体发光体通过通过三棱镜三棱镜或或光栅光栅色散后得到的色散后得到的光谱光谱，为为发射光谱发射光谱，不同的发光体（光源）有其独特的发，不同的发光体（光源）有其独特的发射光谱。射光谱。 2. 吸收光谱吸收光谱 物质的原子或分子物质的原子或分子对光选择性地吸收对光选择性地吸收而得到的而得到的光谱，为光谱，为吸收光谱吸收光谱。 （1） 对对固体物质固体物质来说，当复合光照射到物

9、质上，来说，当复合光照射到物质上，物质对于不同波长的光吸收、透过、反射、折射的物质对于不同波长的光吸收、透过、反射、折射的程度不同而使物质呈现不同的颜色。程度不同而使物质呈现不同的颜色。 对各种波长的光对各种波长的光完全吸收完全吸收则呈现则呈现黑色黑色；完全反完全反射射则呈现则呈现白色白色；吸收程度差不多吸收程度差不多则呈现则呈现灰色灰色。 如果某如果某固体物质固体物质只吸收了部分波长的光，这种只吸收了部分波长的光，这种物质则呈现出物质则呈现出反射光的颜色反射光的颜色。 （2） 对对溶液溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的分子或离子于溶液中的分子或离子选择

10、性地吸收某种波长的光选择性地吸收某种波长的光所引起的。所引起的。 如果各种光如果各种光透过程度相同透过程度相同，这种溶液是，这种溶液是无色透无色透明明的。的。 若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，这溶液则呈现出吸收，这溶液则呈现出透过光的颜色透过光的颜色，是它吸收光，是它吸收光的互补颜色。的互补颜色。 表表1-1列了物质颜色与吸收光颜色之间的关系。列了物质颜色与吸收光颜色之间的关系。 将表中相对应的光按一定的比例混合，可将表中相对应的光按一定的比例混合，可以成为白光，因此，这两种光称为互补色光。以成为白光，因此，这两种光称为互补色光。表表1-1

11、 物质的颜色和吸收光颜色的关系物质的颜色和吸收光颜色的关系 物质的颜色物质的颜色 吸收光吸收光 颜色颜色 波长（波长（nm） 黄、绿黄、绿 紫紫 400450 黄黄 蓝蓝 450480 橙橙 青、蓝青、蓝 480490 红红 青青 490500 紫、红紫、红 绿绿 500560 紫紫 黄、绿黄、绿 560580 蓝蓝 黄黄 580600 青、蓝青、蓝 橙橙 600650 青青 红红 650750 第二节第二节 吸收光谱分析法吸收光谱分析法一、吸收光谱分析法的基本定律一、吸收光谱分析法的基本定律 朗伯朗伯-比尔比尔（Lambert-Beer）定律是讨论）定律是讨论吸收吸收光能光能与与溶液浓度溶液

12、浓度和和液层厚度液层厚度之间关系的基本定律，之间关系的基本定律，它是分光分析的理论基础。它是分光分析的理论基础。 朗伯朗伯-比尔定律适用于比尔定律适用于可见光、紫外光、红外可见光、紫外光、红外光光和和均匀非散射均匀非散射的液体。的液体。透光度：透光度：透过光强度（透过光强度（I）与与入射光强度（入射光强度（I0）之之比比用用 T 表示表示： T = I / I0 T100称为百分透光度（称为百分透光度（T% ）。）。吸光度：吸光度：透光度的负对数透光度的负对数用用A表示表示 A = -LgT= Lg I0/I A = kbc 式中式中k为吸光系数（常数），为吸光系数（常数），c为浓度，为浓度，

13、b为液层厚为液层厚度，该式是分光分析的度，该式是分光分析的定量公式定量公式。 I0I二、偏离朗伯二、偏离朗伯-比尔定律的因素比尔定律的因素 被测物质的被测物质的浓度浓度与与吸光度吸光度成成正比正比，以两者关系作，以两者关系作图得到图得到一条通过原点一条通过原点的的直线直线。但在实际测定中，往往。但在实际测定中，往往有偏离定律的现象。导致偏离定律的主要原因有有偏离定律的现象。导致偏离定律的主要原因有光学光学和和化学化学两方面的因素。两方面的因素。1、光学因素、光学因素 朗伯朗伯-比尔定律比尔定律成立成立的的重要前提重要前提是是单色光单色光，但在，但在实际测定中使用的入射光并不是实际测定中使用的入

14、射光并不是100 %纯的单色光，纯的单色光，会有其它波长的光混杂入，不纯的单色光是引起偏会有其它波长的光混杂入，不纯的单色光是引起偏离的离的主要因素。主要因素。 比色分析要比色分析要注意校准波长注意校准波长，特别是在气候变化时。，特别是在气候变化时。2、化学因素、化学因素 被测物的被测物的浓度、浓度、pH、溶剂和温度、溶剂和温度等均可影响比色等均可影响比色分析的分析的线性线性，被测物的离解、缔合，被测物的离解、缔合或或形成新的物质等形成新的物质等原因也可导致溶液各组分间比例发生变化，若各组分原因也可导致溶液各组分间比例发生变化，若各组分的吸光系数差别较大，则吸光度与浓度间的关系也会的吸光系数差

15、别较大，则吸光度与浓度间的关系也会偏离直线。偏离直线。 在应用朗伯在应用朗伯-比尔定律的实际工作中，溶液应该是比尔定律的实际工作中，溶液应该是一个一个均匀体系均匀体系，否则吸光度与溶液的浓度不成直线关，否则吸光度与溶液的浓度不成直线关系。系。 各份待测各份待测溶液颜色的溶液颜色的深浅深浅要相近。要相近。3、透光度与吸光度转换的误差、透光度与吸光度转换的误差 为了减少误差，掌握好仪器的透光度或吸光度为了减少误差，掌握好仪器的透光度或吸光度的读数范围至关重要，因而透光度与吸光度的准确的读数范围至关重要，因而透光度与吸光度的准确度是衡量仪器精度的指标之一。度是衡量仪器精度的指标之一。三、吸收光谱分析

16、的特点三、吸收光谱分析的特点1、可见光分光分析特点：、可见光分光分析特点： （1）灵敏度高）灵敏度高 最低的检测浓度可达最低的检测浓度可达10-7g/ml，通常物质浓度在，通常物质浓度在10-510-2mol/L范围内较为合适。范围内较为合适。（2）操作简便、快速、应用广泛、重服性好）操作简便、快速、应用广泛、重服性好 。（3）可见光的）可见光的比色池比色池以以光学玻璃光学玻璃作入射和出射光学面。作入射和出射光学面。2、紫外分光分析特点：、紫外分光分析特点： 紫外分光分析法除具备灵敏度高、操作简便及应紫外分光分析法除具备灵敏度高、操作简便及应用广泛等特点外，更重要的是用广泛等特点外，更重要的是

17、无需显色无需显色，无论是有色，无论是有色或无色溶液，只要在紫外光区有特异性吸收峰即可进或无色溶液，只要在紫外光区有特异性吸收峰即可进行定性或定量分析，故行定性或定量分析，故不破坏标本不破坏标本。 紫外分光分析法的紫外分光分析法的比色池比色池要求用要求用不吸收紫外线不吸收紫外线的的石英玻璃石英玻璃作入射和出射的光学面作入射和出射的光学面 。 紫外分光分析法除可采用标准品比较检测外，还紫外分光分析法除可采用标准品比较检测外，还可采用被测物质的可采用被测物质的克分子吸光系数克分子吸光系数计算其含量，而计算其含量，而无无需标准管。需标准管。四、可见紫外分光分析仪四、可见紫外分光分析仪（一）（一）仪仪器的主要部件器的主要部件 1、光、光 源源 : 白炽灯、氢弧灯或氘灯白炽灯、氢弧灯或氘灯 (3601000nm )(150400nm )2、单、单 色色 器器: 滤光片、三梭镜、光滤光片、三梭镜、光 栅栅 3、吸、吸 收收 池池: 比色杯（玻璃杯或石英杯）比色杯（玻璃杯或石英杯）4、检、检 测测 器器: 硒光电池、光电管、光电倍增管硒光电池、光电管、光电倍增管5、指、指 示示 器器: 检流计、微安表、数字显示器检流计、微安表、数字显示器 6、其、其 它：它：1.数字显示器数字显示器 2.吸光度调零旋钮吸光度调零旋钮 3.选择开关选择开关 4.吸光度调斜率电位器