光谱分析技术hu

1、内容提要1.物质的吸收光谱物质的吸收光谱2.分光光度法基本原理分光光度法基本原理透光率和吸光度透光率和吸光度Lambert-Beer定律定律3.可见分光光度法可见分光光度法分光光度计分光光度计测定方法测定方法4.提高测量灵敏度和准确度的方法提高测量灵敏度和准确度的方法5.紫外分光光度法简介紫外分光光度法简介基本要求n了解光的基本性质及物质对光的选择性吸收。了解了解光的基本性质及物质对光的选择性吸收。了解吸收光谱的意义。吸收光谱的意义。n掌握分光光度法的基本原理，掌握分光光度法的基本原理，Lambert-Berr定律以定律以及透光率、吸光度、摩尔吸光系数、质量吸光系数及透光率、吸光度、摩尔吸光系

2、数、质量吸光系数等基本概念及相互关系。等基本概念及相互关系。n了解分光光度计的基本构造，熟悉可见分光光度法了解分光光度计的基本构造，熟悉可见分光光度法的测定方法的测定方法-标准曲线法和标准对照法，了解比吸标准曲线法和标准对照法，了解比吸光系数比较法和差示分光光度法。光系数比较法和差示分光光度法。n了解提高测量灵敏度和准确度的方法。了解提高测量灵敏度和准确度的方法。n了解紫外分光光度法的一般概念了解紫外分光光度法的一般概念 第一节 物质的吸收光谱一、物质对光的选择性吸收n光照射某物质，物质能够吸收光，使原有的基态转为激发态，只有当分子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差(E)相等时

3、才能被吸收。M(基态)+ h M*(激发态)n物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。 二、物质的颜色和光的波长的关系二、物质的颜色和光的波长的关系光是光是一种电磁波。自然光是由一种电磁波。自然光是由 不同的电磁波不同的电磁波组成的混合光。组成的混合光。可见光，可见光， 在在400760nm范围。（见表范围。（见表4-5）互补色光互补色光如：黄光如：黄光和蓝光；红光和绿光。和蓝光；红光和绿光。溶液的颜色溶液的颜色实质实质是是它所吸收的色光的互补色它所吸收的色光的互补色。如：日光照射如：日光照射KMnO4，其中其中绿光绿光被吸收，被吸收，故溶液呈故溶液

4、呈紫色紫色。 CuSO4呈呈蓝色蓝色是由于溶液吸收了是由于溶液吸收了黄光黄光。溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。溶液越浓，光选择吸收越多，颜色越深。 比较溶液颜色的深浅，比较溶液颜色的深浅，实质实质比较溶液对光的比较溶液对光的吸收程度吸收程度。n将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量溶将不同波长的单色光依次通过有色溶液，测量溶液的吸光度液的吸光度A(absorbance)。n以波长以波长 为横坐标，吸光度为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，得吸为纵坐标作图，得吸收曲线，或称吸收光谱。收曲线，或称吸收光谱。n吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，

5、用长，用 max表示。表示。n一般，一般， max是定性鉴别物质的基础是定性鉴别物质的基础 。n不同浓度的溶液，不同浓度的溶液， max不变，浓度与峰值成正比，不变，浓度与峰值成正比，这是进行定量分析的依据。这是进行定量分析的依据。 （二）吸收光谱曲线二）吸收光谱曲线 吸收光谱曲线吸收光谱曲线横坐横坐标标 ；纵坐标；纵坐标A。 最大吸收波长最大吸收波长 max 。 同种物质，同种物质，C不同，但不同，但 max都相同。都相同。 maxn三(邻二氮菲)合铁(II)离子的吸收光谱图 max=510nm不同浓度的溶液，max不变，浓度与峰值成正比。第二节 分光光度法基本原理一、透光率和吸光度n入射光

6、强度I0，吸收光强度Ia，透过光强度It， 反射光强度为IrI0 Ia + It + Irn被测溶液和参比溶液的吸收池同样材料和厚度，反射光强度影响相互抵消，上式简化为I0 Ia + It一、透光率和吸光度n透射光的强度It与入射光强度I0之比称为透光率(transmittance)，用T表示n透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。A愈大，溶液对光的吸收愈多。0tII=Tt0lglgII=T-=A光源单色器吸收池检测器显示系统 原子吸收光谱仪的光源原子吸收光谱仪的光源主要采用主要采用空心阴极灯的结构如左空心阴极灯的结构如左图所示。图所示。棱镜的色散原理当含有不同波长的复合光通过棱镜时,由于各

7、种波长的光在棱镜内的折射率不同,因此被分解成不同角度而散开,这种现象被成为棱镜的色散作用.光栅的原理光栅的原理 吸收池吸收池:用于盛试样溶液和参比溶液用于盛试样溶液和参比溶液.玻璃或石玻璃或石英英,厚度厚度0.5, 1,2,5cm. 检测器检测器:将透过吸收池的光强度转换为电讯号将透过吸收池的光强度转换为电讯号的装置的装置. 信号显示系统信号显示系统:一、偏离一、偏离BeerBeer定律导致的误差定律导致的误差影响测定结果的相对误差两个因素：影响测定结果的相对误差两个因素： T和和T TlElEAClCETAlg1lgTTTCClg434. 0浓度的相对误差二、测量误差及测量条件的选择二、测量

8、误差及测量条件的选择 测量误差主要是指透光率测量误差续前%5 . 0%1%2 . 0TT今假设大多数分光光度计的适宜测量范围7 . 02 . 0%20%65：AT测定结果相对误差较小续前吸光度测量的条件选择：吸光度测量的条件选择：1）测量波长的选择：2）吸光度读数范围的选择：3）参比溶液(空白溶液)的选择： 注：采用空白对比消除因溶剂和容器的吸收、光的散射和 界面反射等因素对透光率的干扰样参调节光路光学性质和厚度相同样品池样品溶液，参比池空白溶液样品池参比池配制样品的溶剂空白溶液ATA%1000下测定须在较小的左右测定灵敏度高maxmaxmaxmaxlCAEAA消除干扰的方法消除干扰的方法 1

9、朗伯朗伯-比耳定律的物理意义是什么？写出其数学表比耳定律的物理意义是什么？写出其数学表达式。达式。2摩尔吸光系数摩尔吸光系数的物理意义是什么？其大小与哪些的物理意义是什么？其大小与哪些因素有关？因素有关？在分析化学中有何意义？在分析化学中有何意义？3什么是吸收曲线？什么是标准曲线？它们有何实什么是吸收曲线？什么是标准曲线？它们有何实际意义？际意义？4显色反应如何选择？显色反应如何选择？5吸光度测量条件如何选择？吸光度测量条件如何选择？6光度分析法中，参比溶液应如何选择？光度分析法中，参比溶液应如何选择？答案答案1.答：当一束平行的单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶液的吸光度A与液层的厚度b

10、和溶液的浓度c成正比。即A= lg(I0 / I) = bc2.答：摩尔吸光系数在数值上等于1molL-1吸光物质在1cm光程中的吸光度。它是吸光物质在特定波长下的一个特征常数。其单位为L mol-1 cm-1。由于值与入射光波长有关，故表示时，应注明所用入射光波长。在分析化学中，值的大小反应了：（1）吸光物质对某一特定波长光吸光能力大小的量度。值越大，该吸光物质的吸光能力越强。（2）衡量光度分析方法灵敏度的重要指标，值越大，方法的灵敏度越高。3.答：以入射光波长作横坐标，用分光光度计测量每一波长下物质对光的吸光度作纵坐标所绘制的曲线，称为吸收曲线。其作用是：选择入射光波长，在此波长下测量吸光

11、度，则分析的灵敏度最高。因此，吸收曲线是吸光光度法中选择测定波长的重要依据。 在某特定波长下，用分光光度计测量一系列不同浓度的标准溶液的吸光度，然后以浓度为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标所绘制的曲线，称为标准曲线（亦称工作曲线）。它是作为待测物质定量分析的依据。如果在相同条件下测得待测试液的吸光度值，从标准曲线上就可查得待测试液的浓度，这就是标准曲线法。4.答：显色反应的选择原则是：（1）选择生成的有色物质（MR）的较大的显色反应；（2）显色剂（R）在测定波长处无吸收 ，即尽可能小；（3）反应生成的有色物质（MR）的组成要恒定，化学性质稳定。5.答：吸光度测量条件包括三个主要方面： （1）入射

12、光波长的选择： 入射光的波长应根据吸收曲线选择max为宜。因在此波长处值最大，使测定具有较高的灵敏度。 （2）参比溶液的选择： 在吸光度的测量中，由于比色皿的反射以及溶剂、试剂等对光的吸收，使得 测得的吸光度值不能真实地反映待测物质对光的吸收 ，也就不能真实地反映待测物质的浓度。为了校正上述影响需要正确选择参比溶液。通过调节仪器使参比溶液的吸光度为零（A= 0）,或透光度T= 100% 。借此消除上述影响。 （3）吸光度读数范围的选择 吸光度值太大或太小时，读数波动所引起的吸光度读数误差较大，为了减小读数误差，应使测量的吸光度值控制在A= 0.151.0（或透光度T在75%10%）范围之内。可

13、以采用以下措施：（a）控制溶液的浓度，如改变试样的称量，或改变溶液的稀释度等；（b）选择不同厚度的比色皿，以改变光程的长度。6.答：参比溶液的选择原则如下： （1）若仅待测物（M）与显色剂（R）的反应产物（MR）有吸收，可用蒸馏水作参比溶液。 （2）若待测物（M）无吸收 ，而显色剂（R）或其它试剂（R）有吸收 ，则用不加试样的空白溶液作参比溶液。 （3）若试样中的其它组分有吸收（待测物M之外的组分，如N），但不与显色剂反应，当显色剂无吸收时，可用试样溶液作参比溶液；当显色剂有吸收时，可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。 总之，选择参比溶液的原则是：应使测得的

14、试液的吸光度能真正反映待测物的浓度。第五节第五节 分光光度法的应用分光光度法的应用注意事项（1）至少要有）至少要有5-7个标准点，且不得随意延长。个标准点，且不得随意延长。（2）待测样品的浓度应包括在标准曲线浓度范围内。）待测样品的浓度应包括在标准曲线浓度范围内。（3）待测样品与标准溶液要在完全相同的条件下测定。）待测样品与标准溶液要在完全相同的条件下测定。 在实际工作中，有时标准曲线并不通过原点，其原因在实际工作中，有时标准曲线并不通过原点，其原因比较复杂，可能是由于：参比溶液选择不当；吸收池比较复杂，可能是由于：参比溶液选择不当；吸收池位置不妥；吸收池壁厚度不等或透光面不洁等；有色位置不妥

15、；吸收池壁厚度不等或透光面不洁等；有色络合物的解离度教大，特别是在溶液中有别的络合物络合物的解离度教大，特别是在溶液中有别的络合物时，常使被测物在低浓度时显色不全，致使标准曲线时，常使被测物在低浓度时显色不全，致使标准曲线低于原点等。低于原点等。xA= abca + bbcb A= abca + bbcb 5.3 分光光度法的具体应用分光光度法的具体应用5.3.1 蛋白质测定蛋白质测定 双缩脲法双缩脲法 考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250染色法染色法5.3.2 核酸测定核酸测定5.3.3 叶绿素的测定叶绿素的测定 双缩脲双缩脲 加热NH322H1800双缩脲22222双缩脲反应:碱性环境 H2O O=C C=O HN NH R-CH CH-R O=C Cu C=O HN NH R-CH CH-R H2O 紫色络合物 双缩脲试剂双缩脲试剂 蛋白质含有两个以上的肽键（与双缩