PFGE(脉冲场凝胶电泳)标准操作规程(SOP)

1、PFGE（脉冲场凝胶电泳） 标准操作规程(SOP关键词：PFGE，脉冲场凝胶电泳目的：运用PFGE方法对20Kb至数Mb的DNA进行分子分型图谱分析：采用“PFGE脉冲场凝胶电泳分子分型识别系统”（官微：PFGE_CHINA）进行图谱分析。系统主要功能是PFGE图谱分子分型在线识别和处理，提供二叉层级聚树，MLVA、MLST字符类型的最小生成树，SEQUENCE基因片段类型的亲缘树计算和图形绘制，用于分析菌株之间的相关性，协助追踪感染来源以及有效控制疫情。第一天一、  胶块的制备1、  在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml

2、细胞悬浊液（CSB）；2、  在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、  在模具上标记好对应样品的名称； 4、  用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.64.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。5、  取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直

3、到胶块制备好放在水浴摇床中。6、  从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。7、  制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56水浴箱中。8、  在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。9、  将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。注意事项：（1）  用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。（2）

4、0; 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。（3）  在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。（4）  混合物加入模具时不能产生气泡。（5）  在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56水浴箱中。二、  细胞的裂解1、  在50ml的screw-cap tube上做好标记。2、  配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml

5、），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。注意：蛋白酶K要置于冰上，配制好的细胞CLB也要置于冰上。3、  每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。4、  如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（1）  可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。（2）  一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。5、  保证胶块在液面下而不在管壁上。6、  

6、将管子放在54水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。7、  将纯水和TE放在50水浴摇床中预热。三、洗胶块1、  从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。随后的操作中也如此。2、  每管中加入15ml预热的纯水。3、  确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50水浴摇床中，摇10分钟。4、  倒掉水，用纯水再洗一次。、5、  倒掉水，

7、加入15ml预热的TE，在50的水浴摇床中摇15分钟。6、  倒掉TE，用TE重复洗三次，每次1015分钟。7、  倒掉TE，加入10ml TE，放在4冰箱保存备用。注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。四、胶块内DNA的酶切1、  在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。2、  按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。试剂  µl/胶块  µl /10胶块纯水  180µl 

8、 1800µlBuffer D  20µl  200µl总体积  200µl  2000µl注意：缓冲液要置于冰上。3、  在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H的稀释液。4、  小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。5、  用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。6、 

9、0;用同样的方法处理标准株H9812的胶块。7、  将管子放在37水浴中孵育10-15分钟。8、  在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。试剂  µl/胶块  µl /10胶块纯水  175µl  1750µlBuffer D  20µl  200µl酶（10U/µl）  5µl  50

10、81;l总体积  200µl  2000µl注意：（1）  将酶置于冰上，用后立即放在20保存。（2）  用枪头吸出缓冲液H，避免损伤胶块。9、  每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。10、  在37水浴中孵育至少2小时。五、加样（一）将胶块直接粘在梳子齿上1、  调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。2、  从37水浴中取出胶块，平衡

11、到室温。3、  用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。4、  每管加入200µl 0.5×TBE。5、  把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上。6、  用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。7、  把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在5560平衡的1SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝

12、固30分钟左右。8、  记录加样顺序。（二）将胶块直接加在加样孔内1、  调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面有一定间距。用水平仪调整胶槽使其水平。2、  把梳子放入胶槽，从胶槽的中央缓慢倒入100ml熔化的在5560平 衡的1SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。3、  小心拔出梳子。4、  从37水浴中取出胶块，平衡到室温。5、  用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。6、  每块胶加入200µl

13、 0.5×TBE平衡。7、  用小铲将胶块加入加样孔。8、  用溶化的胶封闭加样孔。注意：a  可以在加样孔中加入0.5×TBE，利用毛细作用将胶块沉在加样孔底，尽量避免气泡形成。b  记录加样顺序。六、电泳1、  确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。注意：不要触碰电极。2、  加入2.2L 0.5×TBE,关上盖子。3、  打开主机和泵的开关，确保泵设在70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）和缓冲液在管道中正常循

14、环。4、  打开冷凝机，确保预设温度在14（缓冲液达到该温度通常需要20分钟左右）。5、  打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。6、  设置电泳参数。7、  记录电泳初始电流（通常120145ma）。8、  结束电泳：关机顺序为：冷凝机泵主机。第二天七、图像的获取1、  取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，1：10,000稀释，即在400ml水中加入40µl储存液

15、）。注意：EB是致畸剂。储存在棕色瓶中的EB稀释液可以用3-5次。废弃的EB溶液应妥善处理。2、  将托盘放在摇床上摇25-30分钟。3、  放掉电泳槽中的TBE，用1-2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。4、  戴上手套将用后的EB溶液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如果可能每20-30分钟换一次纯水。5、  用Gel Doc 2000拍摄图像。注意：如果背景干扰分析，可进一步脱色30-60分钟。6、  转换成*.1sc文件用于处理分析

16、。八、数据的分析图像的读取电泳图像通常用BIO-RAD的GEL DOC 2000或其它成像系统来获取。其它可以替代的成像设备，只要具有CCD相机，可以提供IBM兼容的未压缩的TIFF图像，且分辨力768 x 640像素，能够用BioNumerics software (Applied Maths, Inc.软件与PulseNet数据库中其它图像进行对比分析，也可以运用。运用GEL DOC 2000的简单说明：QUANTITY ONE软件1、  点击QUANTITY ONE按钮打开该软件。2、  点击菜单FILEGEL DOC。注意：需要1020秒打开窗口

17、。3、  打开抽屉，把胶放在台板上。胶已经经过EB或GEL-STAR染色并经过充分脱色。用黑色胶框把胶放在合适的位置。关上抽屉门。图像的获取1、  按下EPI-LIGHT按钮打开白光。2、  把胶放在调准网格线内，使胶的加样孔和调准网格线的最上面一条蓝线对齐。3、  保证调准网格线和过饱和按钮被选中。4、  改变镜头的MIDDLE RING以调整图像的大（顺时针）小（逆时针），使图像占据整个窗口。如果需要，挪动胶在台板上的位置。胶的加样孔、下边界和左右边界在屏幕上都应该可以看到。5、 

18、 如果需要，按BOTTOM RING以调整相机的焦距。注意：焦距的调整只可以偶尔用之，不可用于每一块胶。可以用尺子帮助调整焦距。6、  按下EPI-LIGHT关掉白光，按下UV按钮打开透射紫外光。7、  点击AUTO EXPOSE以确定大概的曝光时间。当图像出现在窗口时，AUTO EXPOSE自动关闭而MANUAL EXPOSE被激活。8、  点击MANUAL EXPOSE的按钮，调整曝光时间。而调整饱和度时，点击箭头或TURN THE TOP RING以降低光量（如果图像过饱和，图像显现红色）。注意：如果出现对话框“曝光可

19、以在0.03360秒之间波动”，则需通过改变相机的像素以调整饱和度。调整饱和度使样品条带没有红色很重要，因为这会影响BIONUMERICS软件对胶图像的分析。而胶加样孔的过饱和属于正常现象。9、  当图像调整的比较满意时，按下FREEZE按钮停止曝光过程。按下UV按钮关掉紫外光（如果开门时UV灯打开，它会自动关闭）。图像的输出1、  保存图像（*.1sc）：FILESAVE。确保选择正确的路径。文件默认的名字包括日期、时间和用户。可以改变文件名。2、  打印文件：FILEPRINTVIDEO PRINT，也可以直接点击屏幕上的PRIN

20、T按钮。3、  转为*.TIFF格式：FILEEXPORT TO TIFF IMAGEEXPORT，选择正确的路径。4、  关闭QUANTITY ONE程序：FILEEXIT。5、  取出胶放在染色盒内。用软麻布擦掉台板表面多余的液体，用水或70的异丙醇洗干净。试剂储存液的配制1、1 M Tris HCl, pH 8.0*121.1 g Tris base溶于650-700 ml纯水中，加入80 ml 6 N HCl*，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。或者157.6 g Tris-HCl溶于800 ml纯

21、水中，在室温下调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，高压灭菌。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于800 ml纯水中，冷却到室温，加灭菌的纯水使终体积至1000 ml。  3、0.5 M EDTA, pH 8.0*18   6.1 g Na2EDTA 2H2O溶于800 ml纯水中，加入50ml 10N NaOH调pH至8.0，加水终体积至1000 ml，分成数份，高压灭菌。4、20% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS*十二烷基硫酸钠用于E. coli O157:H7, Salmonella and Shige

22、lla sonnei, PFGE将20克SDS小心加入装有80 ml灭菌纯水的容器中，在35°- 45°C轻轻混匀溶解，定容至100ml。5、20 mg/ml 蛋白酶K储存液*100 mg Proteinase K 粉末溶于5 ml 灭菌纯水中，混匀，分装在1.5 ml离心管中，每管500-600 l，-20°C保存备用。6、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE, pH 8.3*0.9 M Tris base (108 g0.9 M Boric Acid (55 g0.02 M EDTA, pH 8.0 (40 ml 0.5 M溶于10

23、00 ml灭菌的纯水中，高压灭菌注意：如果缓冲液有沉淀生成必须丢弃。7、Ethidium Bromide（EB）*10 mg/ml EB的储存液用纯水1:10,000 稀释(即100 ml水中加入10 l储存液，（500ml水中加50ul）。稀释液在丢弃前可以染5-6块胶。实验试剂注意：用灭菌的玻璃制品、塑料制品和纯水来制备以下试剂。1、Tris:EDTA Buffer (TE, pH 8.0*（10 mM Tris-HCL:1 mM EDTA , pH 8.0）  10 ml 1 M Tris-HCL, pH 8.0  2 ml 0.5 M EDTA,

24、 pH 8.0 用灭菌的纯水稀释到1000 ml在E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei, and Campylobacter jejuni PFGE 用TE Buffer 于:. 溶解1% SeaKem Gold:1% SDS agarose. 细菌裂解后洗胶块在L. monocytogenes PFGE 用TE Buffer于:.悬浮菌细胞 . 细菌裂解后洗胶块2、Cell Suspension Buffer (CS100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH 8.0用于E. coli O157:

25、H7, Salmonella, and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.020 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0用灭菌的纯水稀释到100 ml3、Cell Lysis Buffer（CLB）50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH 8.0 + 1% N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl，0.1mg/ml Proteinase K (用前再加入用于裂解E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei,和 Campylobac

26、ter jejuni 25 ml 1 M Tris-HCl, pH 8.050 ml 0.5 M EDTA, pH 8.050 ml 10% Sarcosyl 3用灭菌的纯水稀释到500 ml，每5 ml CLB加入25l蛋白酶K储存液(20 mg/ml，使其终浓度为0.1 mg/ml.5、0.5X TBE Buffer 200 ml 5X TBE用纯水稀释到2000 ml或100 ml 10X TBE用纯水稀释到2000 ml注意：用来稀释5X TBE、10X TBE的纯水可以不灭菌。6、SeaKem Gold Agarose做胶块； 电泳胶报价 seakem gold

27、琼脂糖 25g 货号50111，1567元人民币。可打9折。125g 货号 50150 ，BMA， 6422元。 北京基因公司 10-66001657；上海广州020-85524841天津 02223011926；西安成都沈阳南武汉昆明杭州沙重庆南京无菌

28、的超纯水8、蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液（20mg/ml） 6、限制性内切酶E. coli O157:H7, Salmonella, Shigella sonnei    XbaI,，AvrII (同切限制内切酶BlnI，SpeI    (NotI可用于S. sonnei；但不用于E. coli O157:H7   L. monocytogenes，  AscI, ApaI  Campylobacter jejuni, C. coli，S

29、maI, KpnI器 材1、Dade Microscan Turbidity MeterSpectrophotometerbioMérieux Vitek Colorimeter调整细胞悬浊液的浓度2、微波炉溶胶3、水浴摇床裂解胶块中的细胞(54°C用水和TE(50°C洗胶块4、56°C水浴箱平衡和保温熔化的胶5、25°C, 30°C, 37°C水浴箱酶切6、50°C水浴箱加热用于洗胶块的水和TE，酶切7、离心机。8、最少需要两个水浴箱一个平衡到56°C，另一个到37°C。如果需要，温度可以上下

30、调动。Listeria PFGE中胶块的ApaI酶切需30°C水浴。耗 材1、  无菌的Falcon 2054（12-mm x 75-mm）或Falcon 2057（17-mm x 100-mm）用于细胞悬浊液的制备基因公司代理 ，2、无菌的聚酯纤维或棉签用于从琼脂平板上刮取细菌3、无菌的枪头或巴斯得吸管4、无菌的1.5 ml离心管用于混合细胞悬浊液和胶、酶切5、无菌的50 ml screw-cap tubes 或50 ml Oak Ridge tubes 用于装胶块， 6、  Green Screened Caps（Bio-Rad

31、1703711）洗胶块时用伯乐公司 货号 170-3711。7、模具10孔（可重复利用的，2cm x 1cm x 1.5mm）50孔（一次性的，1.5mm x 10mm x 5mm8、单刃剃须刀、手术刀、平皿或类似物用于切胶块9、无菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃载物片用于切胶块10、  一端宽、一端窄的平铲药铲，生工等公司的实验室耗材部分有。11、标准胶槽（14 x 13cm的框和平板） 12、10孔的梳子（14 cm长，1.5 mm宽）13、15孔的梳子（21 cm长，1.5 mm宽）Bio-Rad 170-362714、胶水平台15、盛放EB染液的塑料容器16、

32、70异丙醇、5%10%的漂白剂或其它合适的消毒剂17、各种体积的无菌烧瓶或瓶子（50 ml - 2000 ml）18、各种规格的无菌量筒（100 ml - 2000 ml）19、无菌的吸管（2 ml - 50 ml）20、保护性手套（无石化粉的乳胶手套、聚乙烯手套或腈类手套）21、防热性手套22、冰盒名称：免疫组化 标准操作规程(SOP关键词：免疫组化目的：规范免疫组化操作主要步骤:1、脱蜡和水化 脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60恒温箱中烘烤20分钟。 1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟； 4）70%乙醇中浸泡5分钟； 2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯