新教材选修3专5课2.PCR技术

1、DNA(DNA(基基因因) )的的功能功能贮存贮存遗传信息（脱氧核苷酸的排列顺序）遗传信息（脱氧核苷酸的排列顺序）复制复制( (传递传递) )遗传信息遗传信息表达遗传信息表达遗传信息转转 录录翻翻 译译场所场所模板模板原料原料产物产物特点特点复习：基因功能的比较复习：基因功能的比较细胞核细胞核细胞核细胞核核糖体核糖体DNA的两条链的两条链DNA一条链的一条链的部分片段部分片段RNA单链单链四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸四种核糖核苷酸四种核糖核苷酸20种氨基酸种氨基酸子代子代DNAmRNA蛋白质蛋白质边解旋边复制边解旋边复制 半保留复制半保留复制A-TA-U、T-AA-U、U-A选修选修1专题专题

2、2课题课题2 PCR技术技术l知识回顾：知识回顾：1.DNA分子的结构（外侧、内侧、基分子的结构（外侧、内侧、基本单位）；本单位）；2. DNA复制过程和特点；复制过程和特点；3.PCR技术技术概念及应用。概念及应用。l基本概念：变性、复性、基本概念：变性、复性、Taq DNA聚合酶、引物聚合酶、引物l理解理解PCR技术的原理技术的原理l掌握掌握PCR技术的全过程技术的全过程l比较比较PCR技术和体内技术和体内DNA复制的异同点。复制的异同点。l（一）、（一）、PCRPCR技术的概念技术的概念 是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增DNADNA片段的片段的技术，它能以极少量的技术，它能以极少量的

3、DNADNA为模板，为模板，在几小时内复制出上百份的在几小时内复制出上百份的DNADNA拷贝拷贝l（二）、（二）、PCRPCR技术的应用技术的应用l遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和学、基因克隆和DNADNA序列测定序列测定q从蓝藻里面克从蓝藻里面克隆隆SODSOD( (超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶) )清除人体内细胞中自由基清除人体内细胞中自由基抗氧化、抗辐射、消炎、抗抗氧化、抗辐射、消炎、抗衰老、抗癌衰老、抗癌高压氧中毒、肺气肿、糖尿高压氧中毒、肺气肿、糖尿病、早衰病、早衰食品、保健品、药品、化妆食品、保健品、药品、化妆品品基因库检索基因库检索

4、SODSOD的序列的序列 设计引物设计引物以蓝以蓝藻总藻总DNADNA位模板做位模板做PCRPCR获得的基因片断连接获得的基因片断连接在表达载体在表达载体原核表达蛋白原核表达蛋白q检测粉末样品检测粉末样品是否含有炭疽杆是否含有炭疽杆菌菌 炭疽菌恐慌，降临美国，炭疽菌恐慌，降临美国，席卷全球席卷全球生命力强、传染快、发作生命力强、传染快、发作快、死亡率高。快、死亡率高。有两对引物是根据编码有两对引物是根据编码炭疽杆菌炭疽杆菌EFEF因子的基因子的基因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的因序列设计的，仅与各种炭疽杆菌的EFEF因子因子同源。同源。PCRPCR产物是产物是1247bp1247bp和和208

5、bp208bp的片断。非的片断。非炭疽杆菌均呈阴性。炭疽杆菌均呈阴性。用营养肉汤培养用营养肉汤培养2 2小时小时取培养液直接作取培养液直接作PCRPCRq基因测序基因测序l（三）、（三）、 PCRPCR技术的原理技术的原理解旋酶解旋酶DNA母链母链4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物（引物（ RNA）打开打开DNADNA双链双链模板模板合成子链的原料合成子链的原料催化催化子链子链合成合成使使DNA聚合酶能从聚合酶能从引物引物3端开始连接端开始连接脱氧核苷酸脱氧核苷酸变性（变性（80-100）Taq聚合酶（耐高温）聚合酶（耐高温）2030个核苷酸构个核苷酸构成成,是一小段是一小段DN

6、A或或RNAATP提供能量提供能量l（1 1）DNADNA单链两端的命名单链两端的命名基本单位脱氧核苷酸脱氧脱氧核糖核糖磷酸磷酸T1号碳5号碳3号碳连连 接接 ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端（含羟基）3，端5，端DNADNA单链两端的命名单链两端的命名lDNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNADNA，而只能从而只能从33端延伸端延伸DNADNA链。链。因此，因此，DNADNA复制需要引物。复制需要引物。 思考：思考：DANDAN复制的前提是什么？复制的前提是什么？ 体体外扩增外扩增DNA DNA 如何打开双链？如何打开双链？ 双链的解开双链的解开控制温度控制温度D

7、NA双链双链单链单链变性（加热变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）复性（缓慢冷却）4、DNA 分子的热变性原理：分子的热变性原理： PCR仪原理仪原理变性的目的：变性的目的：复性的目的：复性的目的：解开双链解开双链有利于引物有利于引物和引物和引物与两条单与两条单链的结合链的结合P21托马斯托马斯.布鲁克布鲁克lDNADNA模板；模板；l分别与两条模板链相结合的两种分别与两条模板链相结合的两种引物；引物；l四种脱氧核苷酸；四种脱氧核苷酸；l耐高温的聚合酶；耐高温的聚合酶；l 控制温度，但不需解旋酶控制温度，但不需解旋酶. .l以便增加大分子模板以便增加大分子模板DNADNA彻底变彻底变性的概

8、率性的概率1、循环之前的一次预变性、循环之前的一次预变性2、PCR 一般要经历一般要经历三十多三十多次循环次循环l（1 1）变性：当温度上升到变性：当温度上升到90 90 以上时，以上时，双链双链DNADNA解聚为单链。解聚为单链。l（2 2）复性：温度下降到）复性：温度下降到50 50 左右，两种左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链引物通过碱基互补配对与两条单链DNADNA结合。结合。l（3 3）延伸：温度上升到）延伸：温度上升到7272左右，溶液中左右，溶液中的的四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸(A(A，T T，C C，G)G)在在DNADNA聚合聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成酶

9、的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的新的DNADNA链。链。3、每个循环包括、每个循环包括：变性变性 复性复性延伸延伸9595变性变性9595变性变性9595变性变性5555复性复性4、循环特点：、循环特点：上一次循环的产物为下一循环的模板上一次循环的产物为下一循环的模板 结果单链中有最初母链的只两条（无引物结果单链中有最初母链的只两条（无引物存于两个子代存于两个子代DNADNA分子中分子中 其它子代其它子代DNADNA分子都为双引物分子式分子都为双引物分子式 处于两引物之间的处于两引物之间的DNADNA序列呈指数增长序列呈指数增长1 12 2N N准备好准备好PCRPCR反应体系的配方反应

10、体系的配方用微量移液器按配方在微量试管中用微量移液器按配方在微量试管中加入各组分加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁离心离心1010分钟分钟将离心管放入将离心管放入PCRPCR仪上，设置好循环程序仪上，设置好循环程序电泳检测电泳检测PCRPCR结果结果l 操作提示操作提示l 1 1为避免外源为避免外源DNADNA等因素的污染，等因素的污染，PCRPCR实验中实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行在使用前必须进行高压灭菌高压灭菌。l 2 2PCRPCR所用的缓冲液和酶应所用的缓冲液和酶应分装成小份分

11、装成小份，并，并在在-20-20储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在放在冰块上缓慢融化冰块上缓慢融化。l 3 3在微量离心管中添加反应成分时，每吸取在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换枪头都必须更换。所有。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微，再将微量离心管放在离心机上，离心约量离心管放在离心机上，离心约10s10s，使反应液，使反应液集中在离心管底部，再放入集中在离心管

12、底部，再放入PCRPCR仪中进行反应。仪中进行反应。目的：目的：避免外源性避免外源性DNA大量扩增造成假阳性反应。大量扩增造成假阳性反应。l1 1、原理：、原理：DNADNA在在260nm260nm的紫外线波段有的紫外线波段有一强烈的吸收峰一强烈的吸收峰( (图图5-11)5-11)。可以利用。可以利用DNADNA的这一特点进行的这一特点进行DNADNA含量的测定。含量的测定。l2 2、具体方法如下。、具体方法如下。l1 1）将样品进行）将样品进行5050倍稀释：取倍稀释：取2LPCR2LPCR反反应液，加入应液，加入98 L98 L蒸馏水。蒸馏水。l2 2）以蒸馏水作为空白对照，在波长）以蒸

13、馏水作为空白对照，在波长260nm260nm处，将紫外分光光度计处，将紫外分光光度计( (图图5-12)5-12)的读的读数调节至零。数调节至零。l3 3）加入步骤）加入步骤1 1中的中的DNADNA稀释液稀释液100L100L至比色至比色杯中，测定杯中，测定260nm260nm处的光吸收值。处的光吸收值。l4 4）根据下面的公式计算）根据下面的公式计算DNADNA含量。含量。l DNA DNA含量含量(g/ml)=50 x(260nm(g/ml)=50 x(260nm的读数的读数)x)x稀稀释倍数释倍数l1 1、PCRPCR优点：优点：l2 2、PCRPCR技术的意义技术的意义原理虽然复杂，

14、但操作却十分简单。快原理虽然复杂，但操作却十分简单。快速、高效、灵活和易于操作速、高效、灵活和易于操作 复习：复习：PCRPCR技术与体内技术与体内DNADNA复制的区别：复制的区别： 1. PCR 1. PCR不需要解旋酶；体内不需要解旋酶；体内DNADNA复制复制需要；需要； 2. PCR 2. PCR需要耐热的需要耐热的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；酶在高温时会变性； 3. PCR 3. PCR一般要经历三十多次循环，而一般要经历三十多次循环，而生物体内生物体内DNADNA复制需要生物体自

15、身的复复制需要生物体自身的复制。制。 1 1、书本、书本2 2、课课练、课课练l9 9 下图为下图为PCRPCR过程的前三次循环的图解，请据图回答：过程的前三次循环的图解，请据图回答：l ()()请将请将PCRPCR缓冲液中提供的缓冲液中提供的4 4种组分填写在图中的方框内：种组分填写在图中的方框内：l (2)(2)第一轮循环中变性第一轮循环中变性 是指是指_；复性；复性 是指是指_ _ ；l延伸是指延伸是指_。l (3)(3)假设假设PGRPGR反应中的反应中的DNADNA模板为模板为P P，第一轮循环的产物，第一轮循环的产物2 2个子代个子代DNADNA为为l NlNl，第二轮的产物，第二

16、轮的产物4 4个子代个子代DNADNA为为N2N2，第二轮的产物，第二轮的产物8 8个子代个子代DNADNA为为l N3N3，则，则NlNl、N2N2、N3N3中分别含有模板中分别含有模板DNADNA单链的单链的DNADNA分子分子 ，l _、_个，若继续循环个，若继续循环3636次，则次，则N N 3636中将有中将有个个DNADNA分子含有模板分子含有模板DNADNA单链。单链。l (4)N3(4)N3的的8 8个个DNADNA分子中分子中是以是以N2N2中的中的_为模板复制而来的，为模板复制而来的，l 是以是以N2N2中的中的 为模板复制而采的，为模板复制而采的，是以是以N2N2中的中的

17、 为模为模l 板复制而来的，板复制而来的，是以是以N2N2中的中的 为模板复制而来的。从图中可以为模板复制而来的。从图中可以l看出，看出，DNADNA聚合酶只能特异地复制处于聚合酶只能特异地复制处于2 2个引物之间的个引物之间的DNADNA序列，使这段固定长序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增，原因是度的序列呈指数扩增，原因是_ _ l1 1、DNADNA单链的单链的_末端为末端为3 3, ,端端, , _末端为末端为5 5, ,端端, ,在在DNADNA复制时复制时, ,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,引物提供引物提供_端端, ,使子链

18、向下延伸使子链向下延伸. .l2 2每次循环可以分为每次循环可以分为_这三个过程这三个过程, ,对应温度分别为对应温度分别为_._.l3 3、一个、一个DNADNA片段经过片段经过3030次循环后能形次循环后能形成成_个这样的片段个这样的片段. .l4 4依据依据DNADNA吸收紫外光的情况吸收紫外光的情况, ,用紫外分用紫外分光光度计测得光光度计测得lDNA=_DNA=_l1 1、DNADNA单链的单链的_末端为末端为3 3, ,端端, , _末端为末端为5 5, ,端端, ,在在DNADNA复制时复制时, ,引引物从模板链的物从模板链的_端配对结合端配对结合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,引物提供引物提供_端端,