枯草芽孢杆菌增殖

1、枯草芽孢杆菌增殖培养基优枯草芽孢杆菌增殖培养基优化化 1989 年美国食品与药物管理局FDA 公布了42 种可直接用于畜禽生产的微生物,应用较多的为乳酸杆菌、粪链球菌、酵母菌和芽孢杆菌。从动物生产和饲料工业特点看,芽孢杆菌比其他有益微生物有更多的优点,因而其研究和应用受到广泛重视。目前枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌应用较多。由枯草芽孢杆菌制备而成的微生态制剂具有如下优良特性: 1) 能调节动物肠道菌群平衡,改善肠道微生态环境,促进动物生长和提高抗病力。 2) 在不利环境条件下能以孢子形式存在,在饲料制粒、贮存及胃酸环境中仍能保持高活性。 3)能刺激动物免疫器官的生长发育,激活淋巴细胞,提高免疫球蛋

2、白和抗体水平,增强细胞免疫和体液免疫功能,提高机体免疫力。 4) 能自身合成消化性酶类,如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等,与内源消化酶共同发挥作用,促进养分的消化吸收。文章以一株枯草芽孢杆菌为研究对象,对其摇瓶发酵培养基及发酵条件进行优化,为其规模化发酵提供依据。芽孢杆菌能产生芽孢，在沸水中加热不会失去生理活性，但是不能产生芽孢的细菌会失去活性，因而得到芽孢菌属，经过进一步的分离及生理生化鉴定得到枯草芽孢杆菌。菌种的分离和纯化土样的采集：取土壤表层5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入纸袋带回实验室分离。平板的制备：溶化三角瓶中的牛肉汤蛋白胨培养基，以每皿20ml左右倒6个平板

3、。稀释分离法：称取肥土5g放入含有45ml水的三角瓶中，摇动片刻，然后将此瓶用小火加热至悬浊液沸腾，维持15min。而后静止5min，吸取上层液0.1ml加入到含有4.5ml无菌水的试管中，制成1:100浓度的悬液，然后分别吸取10-2 和 10-3土壤悬浊液各0.2ml滴加到上述牛肉汤蛋白胨培养基平板上（每种稀释度2皿），用涂布棒均匀涂布，并将培养基倒置于37恒温培养1-2天。挑菌及纯化：从上述分离的平板上分别挑取2个单菌落中部分菌体，在牛肉膏蛋白胨培养基上划线纯化，经菌落特征的观察和镜检，确定是芽孢杆菌属纯种后，从中选择一株转接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37培养1-2天后备用。（菌体应呈杆状

4、，具芽孢，宽度一致；菌落颜色、形状、质地、透明度等均一致）菌种活化将保存的菌种转接到斜面培养基,37 培养24 h ,备用。种子液的制备取一环活化的菌种,接入装量为50 mL 种子培养基的250 mL 三角瓶中,37 ,180 r/ min 培养18 h。种子培养基蛋白胨1 % ,酵母浸出物0. 5 % ,氯化钠1 % ,自然pH。基础发酵培养基蔗糖1 % ,蛋白胨1 % ,磷酸氢二钠0. 2 % ,磷酸二氢钠0. 2 % ,pH 7. 0。摇瓶培养分别取1 mL 种子液,接入盛有50 mL 发酵培养基的200 mL 三角瓶中(接种量为2 % ,V/ V) 。置摇床中,30 振荡培养12 h

5、,转速为160 r/ min ,进行单因素和正交实验的发酵条件研究。碳源分别用1 %葡萄糖、淀粉、玉米淀粉和麦芽糖等量替代基础培养基中的蔗糖制成培养基。采用摇瓶发酵培养条件,12 h 后测定发酵液中的活菌含量以确定最佳碳源。氮源分别用1 %酵母浸出物、牛肉膏、尿素、氯化铵、酵母浸出物+ 胰蛋白胨(11) 、酵母浸出物+ 胰蛋白胨+ 氯化铵(221) 及酵母浸出物+ 胰蛋白胨+ 尿素(221) 替代基础发酵液1 %的胰蛋白胨。采用摇瓶发酵培养条件,12 h 后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳氮源。无机盐分别用0. 4 %硫酸锰、硫酸镁、硫酸铁、氯化钠、氯化钙及不加无机盐的空白,替代等量的基础发酵液中磷酸二氢钠(0. 2 %) + 磷酸氢二钠(0. 2 %) 。采用摇瓶发酵培养条件,12 h 后测定发酵液中的活菌含量,以确定最佳无机盐。测定方法活菌总数测定采用稀