实验三_硝酸还原酶活性测定

1、硝酸还原酶硝酸还原酶植物从土壤中吸收的植物从土壤中吸收的NONO3 3必须经代谢性还原才能被利用，因必须经代谢性还原才能被利用，因为为细胞组分中的细胞组分中的N N均呈高度还原态均呈高度还原态，而而NONO3 3中的中的N N为高度氧化为高度氧化态态。硝酸盐的还原由硝酸盐的还原由硝酸还原酶硝酸还原酶(nitrate reductase(nitrate reductase, NR), NR)催化。催化。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。硝酸还原酶存在于细胞液中，为一种诱导酶。诱导酶诱导酶(induced enzyme):(induced enzyme):植物体本来不含有，但在特定外植物体本

2、来不含有，但在特定外来物质来物质( (如底物如底物) )的诱导下的诱导下, ,可以产生的酶。可以产生的酶。受光促进受光促进1. 实验目的意义实验目的意义 掌握硝酸还原酶活性的测定方法掌握硝酸还原酶活性的测定方法了解硝酸还原酶的特性了解硝酸还原酶的特性硝酸还原酶（硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写，缩写NR）是硝酸盐同化中第一）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之

3、因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。一，也可作为品种选育的指标之一。硝酸还原硝酸还原酶可将酶可将NO3-还原成还原成NO2- ，其反应为：，其反应为：NO3- + NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2ONR 在一定条件下，在一定条件下，NO2-的生成量与硝酸还原酶的活性呈的生成量与硝酸还原酶的活性呈正相关，因此，可以测定正相关，因此，可以测定NO2-的生成量来代表硝酸还原酶的生成量来代表硝酸还原酶的的NR活性。活性。2. 实验原理实验原理 NO2-含量测定含量测定（磺胺比色法）（磺胺比色法） 在酸性溶液中，在酸性溶液中，NO2-与磺

4、胺形成重氮盐，重氮盐再与与磺胺形成重氮盐，重氮盐再与-萘胺偶联，形成萘胺偶联，形成紫红色的偶氮化合物紫红色的偶氮化合物。该偶氮化合物在。该偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（有最大吸收峰，可以用分光光度计测定（OD540）。）。（不稳定，见光容易分解，测定需迅速。不稳定，见光容易分解，测定需迅速。）当磺胺与当磺胺与-萘胺均过量时，所生成的红色深浅与萘胺均过量时，所生成的红色深浅与NO2-含量成含量成直线关系。直线关系。 NO2-含量标准曲线：含量标准曲线： NO2- (mol/ml) = 0.00260.359OD540 NR活性活性(NO2- , mol/hgfw) =

5、鲜重鲜重(g)时间时间(h) NO2- (mol/ml)稀释倍数稀释倍数离体法：离体法：将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。为硝酸还原酶粗酶液进行测定。缺点：缺点：由于研磨中由于研磨中NADH受损失，必需外加受损失，必需外加NADH方可测定。方可测定。活体法：活体法：直接用鲜活组织进行测定。环境中的直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO3-进入细胞后进入细胞后被被NR还原成还原成NO2-，并扩散到细胞外在溶液中积累，测，并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中定溶液中NO2- 的含量即可得知的含量即可得知NR的大小

6、。的大小。优点：优点：不破坏细胞原有的酶反应系统，不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不可由代谢反应不断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设断生成，无需外加。简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件。备及低温条件。缺点缺点: 重复性欠佳，应作一定量的重复。重复性欠佳，应作一定量的重复。硝酸还原酶活性测定硝酸还原酶活性测定3. 材料与试剂材料与试剂两种处理的小麦：两种处理的小麦：水水 (ck)， KNO3（N）A液：液：磷酸缓冲液磷酸缓冲液: 水水: DNP溶液溶液: 蔗糖溶液蔗糖溶液 5: 5: 1: 1B液：液：磷酸缓冲液磷酸缓冲液: KNO3: DNP溶液溶液: 蔗糖溶

7、液蔗糖溶液 5: 5: 1: 1 磷酸缓冲液磷酸缓冲液(pH7.5): 0.2mol/L； KNO3溶液溶液: 0.2mol/L DNP (2-4-二硝基苯酚二硝基苯酚)溶液溶液: 1mmol/L； 蔗糖溶液蔗糖溶液: 2.5mmol/L磺胺试剂磺胺试剂-萘胺试剂萘胺试剂 取样前一天，用取样前一天，用50mM KNO3加到培养小麦的水中，加到培养小麦的水中，光照光照，以诱导，以诱导硝酸硝酸还原酶还原酶产生。产生。 两种材料两种材料水水(ck)，KNO3 (N)各取各取2份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、份新鲜叶片中段，用蒸馏水洗净、擦干，剪成擦干，剪成1cm小段，称取小段，称取0.3克；将克；将4

8、份（份（ck、N）叶段分别置于含有）叶段分别置于含有10ml A、B溶液的两只试管中，即溶液的两只试管中，即ckA、ckB、NA和和NB四管；四管； 用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气用纱布将材料压于试管底部，将试管放在真空干燥器中抽气30分钟，分钟，放气后摇晃直至叶段沉于溶液中放气后摇晃直至叶段沉于溶液中； 将试管置于将试管置于2530温箱中，温箱中，黑暗黑暗保温保温30分钟；分钟； 立即吸取立即吸取1ml反应液，加入反应液，加入2ml磺胺试剂，磺胺试剂，摇匀摇匀，再加入，再加入2ml-萘胺试剂萘胺试剂（注意顺序注意顺序），），用漩涡仪混合摇匀用漩涡仪混合摇匀，25 水浴（

9、水浴锅）反应水浴（水浴锅）反应5分钟分钟, 取出后桌面静置取出后桌面静置10分钟，分钟，随后随后5分钟内分钟内，在，在540nm测定样品的吸光值测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照）（以蒸馏水为对照）。 取取A液和液和B液液1ml代替反应液，加入代替反应液，加入2ml磺胺试剂和磺胺试剂和2ml-萘胺试剂，作萘胺试剂，作为对照管，在为对照管，在540nm测定样品的吸光值测定样品的吸光值（以蒸馏水为对照）（以蒸馏水为对照） 。 4. 实验步骤实验步骤两种处理的小麦幼苗叶片两种处理的小麦幼苗叶片中段各取中段各取0.3g (各各2份份) 水水(ck) KNO3 （N）10 mlA液液 B液液A液液 B液液

10、抽气抽气30分钟分钟2530温箱中温箱中黑暗黑暗保温保温30分钟分钟取取1ml反应液反应液+2ml磺胺试剂磺胺试剂+2ml -萘胺试剂萘胺试剂混匀混匀注意加液顺序注意加液顺序25 水浴反应水浴反应5分钟分钟取出后桌面静置取出后桌面静置10分钟分钟540 nm测定样品的吸光值测定样品的吸光值取取A液或液或B液液1ml代替反应液作为代替反应液作为对照管对照管放气后摇晃直至叶放气后摇晃直至叶段沉于溶液中段沉于溶液中5. 结果与分析结果与分析处处 理理 A 液液 B 液液 吸光度吸光度 NO2- NR活性活性 吸光度吸光度 NO2- NR活性活性 （uMol/ml）（uMol/hgfw） （uMol/

11、ml）（uMol/hgfw）H2OKNO3对照对照 NO2- （uMol/ml）= 0.00260.359OD520NR活性（活性（ NO2- , uMol/hgfw）= NO2- 10ml/1ml （鲜重（鲜重g0.5h）分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。分析硝酸盐对硝酸还原酶活性的影响。6. 注意事项注意事项 抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中；抽真空放气后，摇晃直至叶段沉于溶液中； 硝酸还原过程应在黑暗中进行；硝酸还原过程应在黑暗中进行； 磺胺试剂和磺胺试剂和-萘胺试剂加入时，注意顺序；萘胺试剂加入时，注意顺序； 正确使用分光光度计；正确使用分光光度计；避免移液管使用交叉感染。避免移液管使用交叉感染。1） 为何提前一天施为何提前一天施KNO3，并且取样应在晴天进行？，并且取样应在晴天进行？2） NR酶活性（酶活性（ NO2- ，uMol/hgfw）= NO2- 10ml/1ml （鲜重（鲜重g0.5h） 公式中的公式中的0.5 h 指哪一个？指哪一个？7. 思考题思考题酶反应要在暗条