薄层色谱及柱色谱

1、LOGO薄层色谱及柱色谱刘雪丽刘雪丽 刘菲刘菲 李喜梅李喜梅 钟家吉钟家吉LOGO一、实验目的1、掌握色谱法的基本原理及其应用。、掌握色谱法的基本原理及其应用。2、掌握薄层色谱及柱色谱的操作技能。、掌握薄层色谱及柱色谱的操作技能。LOGO二、色谱法基本原理1.色谱法色谱法又称为层析法，是又称为层析法，是分离分离，纯化纯化和和鉴定鉴定有机化合物的重要有机化合物的重要方法之一。方法之一。 2.色谱法的基本原理是利用混合物各组分在两相间（流动相色谱法的基本原理是利用混合物各组分在两相间（流动相和固定相）的和固定相）的吸附或分配（溶解性能）的差异吸附或分配（溶解性能）的差异。即当混合。即当混合物随流动

2、相流经固定相时，由于固定相对各组分的吸附或物随流动相流经固定相时，由于固定相对各组分的吸附或溶解性能的不同，经过溶解性能的不同，经过两相间反复多次的吸附或分配两相间反复多次的吸附或分配，使，使吸附较弱或溶解度较小的组分在固定相中移动较快，从而吸附较弱或溶解度较小的组分在固定相中移动较快，从而使各组分得到分离。使各组分得到分离。3.色谱法的应用色谱法的应用主要包括以下几个方面：主要包括以下几个方面：（1）分离混合物）分离混合物（2）精致提纯化合物）精致提纯化合物（3）鉴定化合物）鉴定化合物（4）跟踪反应进程）跟踪反应进程LOGO三、色谱法的分类（1）薄层色谱：将）薄层色谱：将固定相均匀涂布在表面

3、光滑的平板固定相均匀涂布在表面光滑的平板上，形上，形成薄层来进行物质分离及分析的方法。成薄层来进行物质分离及分析的方法。 按其按其操作不同操作不同，可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相，可分为薄层色谱、柱色谱、纸色谱、气相色谱和高效液相色谱。色谱和高效液相色谱。 （2）柱色谱：将）柱色谱：将固定相装在色谱柱固定相装在色谱柱中，使样品沿着色谱柱移中，使样品沿着色谱柱移动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。动，通过各组分随流动相流动而得到分离的方法。（3）纸色谱：）纸色谱：用滤纸等作为液体的载体用滤纸等作为液体的载体，将样品点在纸上随，将样品点在纸上随后展开而达到分离鉴定的方法。后展开而达到

4、分离鉴定的方法。（4）气相色谱：是）气相色谱：是以气体为流动相以气体为流动相的色谱法的色谱法。LOGO N NN NHO展开剂选用9:1的无水苯乙酸乙脂偶氮苯苏丹LOGO有关化合物的物理性质：LOGO四、薄层色谱1.薄层板的制备：薄层板的制备：（1）固定相的选择：）固定相的选择：吸附色谱：吸附色谱： 氧化铝氧化铝、硅胶硅胶 （H不含黏合剂不含黏合剂）分配色谱的支持剂：硅藻土、纤维素分配色谱的支持剂：硅藻土、纤维素 （F含荧光物质含荧光物质） （G含煅石膏含煅石膏 2CaSO4H2O黏合剂黏合剂) 薄层板的薄层板的制制备备点样点样展开展开显色，计算、分析显色，计算、分析LOGO四、薄层色谱（2）

5、制板：）制板： 干法和湿法干法和湿法取取3g硅胶硅胶G与与6-7mL0.5%-1%的的羧甲基纤维素钠羧甲基纤维素钠的水溶液在烧杯的水溶液在烧杯中中调成糊状物调成糊状物平铺平铺或或浸渍浸渍室温晾干室温晾干后后，放入烘箱内放入烘箱内加热活化加热活化通常用通常用六中染料确定活性六中染料确定活性LOGO四、薄层色谱2.点样点样（2）通常将）通常将样品溶于低沸点溶剂样品溶于低沸点溶剂（丙酮，甲醇、乙醚等），（丙酮，甲醇、乙醚等），根据使用的固定相配成根据使用的固定相配成0.5%-5%的溶液，用内径小于的溶液，用内径小于1mm管口平整的管口平整的毛细管毛细管，在，在起始线上小心点样起始线上小心点样，斑点直

6、径一般，斑点直径一般不超过不超过2-3mm。（1）点样前，先在薄层板上）点样前，先在薄层板上据底端据底端1cm处处，用尺子、铅笔轻，用尺子、铅笔轻画一横线作为起始线。画一横线作为起始线。（3）同一块板可点）同一块板可点几个样品点几个样品点，但是，但是间距应为间距应为1-1.5cm。点点样要轻，不可刺破薄层样要轻，不可刺破薄层！（！（注：因溶液太稀或样点太小，可注：因溶液太稀或样点太小，可重复点样。但应在前次点样的溶剂挥发后，方可重点，以防重复点样。但应在前次点样的溶剂挥发后，方可重点，以防样点被溶解掉。样点过大，造成尾扩散等现象，影响分离效样点被溶解掉。样点过大，造成尾扩散等现象，影响分离效果

7、）果） （4）点样结束，）点样结束，必须待样品点干燥后必须待样品点干燥后，方可进行展开方可进行展开。LOGO四、薄层色谱3.展开展开（2）展开操作：）展开操作：a.先在密闭的展开槽内倒入少量配好的展开剂，先在密闭的展开槽内倒入少量配好的展开剂，高度不能超高度不能超过过1cm。待其蒸气饱和，以达到平衡。（约。待其蒸气饱和，以达到平衡。（约5min）b.将点样后的薄层板放入展槽中，将点样后的薄层板放入展槽中，先不要接触展开剂先不要接触展开剂，让，让薄层板吸附蒸气以达饱和。（约薄层板吸附蒸气以达饱和。（约3min）c.将点样的一端放入展开剂中，垫高薄层板，始终使薄层板将点样的一端放入展开剂中，垫高薄

8、层板，始终使薄层板浸入展开剂为浸入展开剂为0.5cm，展开剂高度绝对不能浸过起始线！展开剂高度绝对不能浸过起始线！（展开剂若高于样品点，会使本就少量的样品溶于展开剂，展开剂若高于样品点，会使本就少量的样品溶于展开剂，难以随展开剂的展开而分离。达不到分析的目的难以随展开剂的展开而分离。达不到分析的目的 ！）！）d.待待溶剂前沿离顶端溶剂前沿离顶端1cm左右，就应取出薄层板左右，就应取出薄层板，待展开剂，待展开剂挥干后，观察分析。绝对不能使展开剂漫过薄层板的端！挥干后，观察分析。绝对不能使展开剂漫过薄层板的端！（1）展开剂的选择：根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性）展开剂的选择：根据样品的极性、

9、溶解度和吸附剂的活性等因素考虑等因素考虑。LOGO四、薄层色谱4.显色、计算及分析显色、计算及分析（1）若）若样品样品本身是本身是有色有色的，可以的，可以直接观察直接观察到分离的过程及结果。到分离的过程及结果。 若无色，则可通过以下几种方法显色：若无色，则可通过以下几种方法显色：碘熏碘熏、紫外光灯紫外光灯、喷显色剂喷显色剂。（2）计算比移值（）计算比移值（Rf）：）：LOGO四、薄层色谱（3）良好的分离，）良好的分离，Rf值应在值应在0.15-0.75之间之间，否则应更换展开剂，否则应更换展开剂重做。重做。通常样品的极性越大，通常样品的极性越大，Rf值越小。值越小。（4）在一定的操作条件下，即

10、）在一定的操作条件下，即色谱条件一定，比移值（色谱条件一定，比移值（Rf）只与组分性质有关，因此可用来鉴定化合物只与组分性质有关，因此可用来鉴定化合物。（定性）。（定性）但是但是Rf值除了决定于物质的结构外，还与吸附剂的含水量、值除了决定于物质的结构外，还与吸附剂的含水量、薄层厚度，展开剂纯度、温度等外界因素有关，因此薄层色薄层厚度，展开剂纯度、温度等外界因素有关，因此薄层色谱几乎不用于定性，谱几乎不用于定性，常用来分析样品中的组分常用来分析样品中的组分。LOGO注意事项：1.一根点样管只能点一种样品，否则有交叉污染。2,软板点样需很轻，否则固定相会粘到点样管下。3,样品点直径应不超过2mm，

11、距离薄层板底部约1cm，样之间间距约11.5 cm，展开时薄层板底部浸入展开剂的高度约0.5 cm。注意样品点决不能浸到开剂中。4.展开剂离薄层板上缘约1 cm时应停止走板，取出晾干。不可使展开剂走到板的尽头。板取出后要及时标记展开剂前沿，否则展开剂挥发后难以确定。LOGO五、柱色谱在色谱柱中填入表面积很大、在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸经过活化的多孔性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。附剂（硅胶、氧化铝）。分离的混合物溶液流过吸附分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同当洗脱剂流下时，由于不同

12、化合物吸附能力不同，往下洗化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱脱的速度也不同，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带。大小分别形成若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收的溶质可以从柱上分别洗出收集。集。吸附柱色谱的工作原理：吸附柱色谱的工作原理：在色谱柱中填入表面积很大、经过活化的多孔性粉状固体吸附剂（硅胶、氧化铝）。分离的混合物溶液流过吸附柱时，各种成分同时被吸附在柱的上端。当洗脱剂流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度也不同，即溶质在柱中自上而下按对吸附剂亲和力大小分别形成

13、若干色带。再用溶剂洗脱时，已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集。LOGO吸附剂的选择：常用的吸附剂：常用的吸附剂：氧化铝氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭、硅胶、氧化镁、碳酸钙和活性炭吸附剂要求：吸附剂要求： 不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用；不能与被分离的物质和展开剂发生化学作用； 吸附剂的粒度大小要均匀。吸附剂的粒度大小要均匀。粒度小，表面积大，吸附能力强，分离效果好，但流速慢粒度小，表面积大，吸附能力强，分离效果好，但流速慢粒度大，表面积小，吸附能力弱，分离效果差，但流速快。粒度大，表面积小，吸附能力弱，分离效果差，但流速快。 酸性酸性（分离酸性物质，如有机酸类化合物）（分离酸性

14、物质，如有机酸类化合物） 中性中性（分离中性物质，如醛、酮、醌和酯类化合物）（分离中性物质，如醛、酮、醌和酯类化合物） 碱性碱性（分离碱性物质，如碳氢化合物、生物碱、胺等）（分离碱性物质，如碳氢化合物、生物碱、胺等） 本实验吸附剂：本实验吸附剂：中性氧化铝中性氧化铝（150目）目）氧化铝对各种化合物的吸附性大小：氧化铝对各种化合物的吸附性大小：酸碱醇胺硫酸酯醛酮芳香族化合物卤代物醚烯饱和烃酸碱醇胺硫酸酯醛酮芳香族化合物卤代物醚烯饱和烃LOGO1.装柱：是柱色谱最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效果。装柱：是柱色谱最关键的操作，装柱的好坏直接影响分离效果。（1）装柱前，应先将玻璃柱洗净，干燥，

15、垂直固定在铁架台上。在）装柱前，应先将玻璃柱洗净，干燥，垂直固定在铁架台上。在柱柱底铺一小块脱脂棉，再铺约底铺一小块脱脂棉，再铺约0.5cm厚的石英砂，然后进行装柱厚的石英砂，然后进行装柱。有。有湿法和湿法两种方式，湿法装柱效果更好。湿法和湿法两种方式，湿法装柱效果更好。五、柱色谱（2）湿法装柱：将固定相（如硅胶）用洗脱剂调成糊）湿法装柱：将固定相（如硅胶）用洗脱剂调成糊状，在状，在柱内先加入约柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂柱高的洗脱剂，再将糊状物，再将糊状物边震荡边倒入柱中，同时，打开下旋塞，用一干净干边震荡边倒入柱中，同时，打开下旋塞，用一干净干燥的烧杯接收洗脱剂。燥的烧杯接收洗脱剂。 待

16、糊状物全部装完后，用接收到的洗脱剂转移残留的待糊状物全部装完后，用接收到的洗脱剂转移残留的固定相，并将柱壁上的固定相淋洗下去。固定相，并将柱壁上的固定相淋洗下去。 装柱过程中，装柱过程中，应不断轻敲色谱柱应不断轻敲色谱柱，以使固定相填充，以使固定相填充均匀、无气泡！均匀、无气泡！ 整个装柱过程中，整个装柱过程中，柱内洗脱剂的高度始终不能低于柱内洗脱剂的高度始终不能低于固定相最上端固定相最上端，否则柱内会出现裂痕和气泡！，否则柱内会出现裂痕和气泡！LOGO五、柱色谱2.展开及洗脱：展开及洗脱： 将将样品溶解在样品溶解在最少量的最少量的洗脱剂洗脱剂中。滴加前，打开下旋塞中。滴加前，打开下旋塞 使洗

17、脱剂流出，使洗脱剂流出，恰好下降到固定相表面时，关闭旋塞恰好下降到固定相表面时，关闭旋塞，开，开 将样品迅速全部滴加于柱顶端将样品迅速全部滴加于柱顶端后，用一事先后，用一事先戳孔的圆形滤戳孔的圆形滤 盖住样品表面，以防加洗脱剂时搅动柱顶表盖住样品表面，以防加洗脱剂时搅动柱顶表 面。面。 样品加完后，打开下旋塞，再立即加入洗样品加完后，打开下旋塞，再立即加入洗 脱剂进行洗脱脱剂进行洗脱。色谱带的展开过程就是样。色谱带的展开过程就是样 品的分离过程，品的分离过程，可按颜色段收集各组分可按颜色段收集各组分。LOGO五、柱色谱洗脱过程中的注意事项：洗脱过程中的注意事项：1. 1.洗脱剂应连续平稳地加入

18、，不能中断洗脱剂应连续平稳地加入，不能中断。2 2. .洗脱剂流出速度洗脱剂流出速度应控制在应控制在每分钟每分钟5-105-10滴滴。下移速。下移速度太快，分离效好，太慢，会造成色谱扩散或成度太快，分离效好，太慢，会造成色谱扩散或成分破坏，影响分离效果分破坏，影响分离效果 注：色谱柱装的好坏，将严重影响分离效果。得注：色谱柱装的好坏，将严重影响分离效果。得 色谱柱，不得使吸附剂有裂缝和气泡，且不得色谱柱，不得使吸附剂有裂缝和气泡，且不得 使液面低于吸附剂或砂层表面。使液面低于吸附剂或砂层表面。思考题1.为什麽在用有机溶剂做洗脱剂时，要求他们必须干燥？为什麽在用有机溶剂做洗脱剂时，要求他们必须干燥？ 柱色谱上用的吸附剂颗粒一般比柱色谱上用的吸附剂颗粒一般比TLC上用的吸附剂颗粒上用的吸附剂颗粒大，柱色的洗脱剂也应比大，柱色的洗脱剂也应比TLC的展开剂极性略小，才能的展开剂极性略小，才能得到较好的分离效果。为此，所用溶剂必须干燥，否则得到较好的分离效果。为此，所用溶剂必须干燥，否则将严重影响分离效果（需要含水溶脱时除外）将严重影响分离效果（需要含水溶脱时除外）2.装柱时如果柱中留有气泡，暗沟，断层或填装不均匀，对装柱时如果柱中留有气泡，暗沟，断层或填装不均匀，